(ОФС 42-0096-09)

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) – это метод колоночной хроматографии, в котором подвижной фазой (ПФ) служит жид-

кость, движущаяся через хроматографическую колонку, заполненную непод-

вижной фазой (сорбентом). Колонки для ВЭЖХ характеризуются высоким гидравлическим давлением на входе в колонку, поэтому ВЭЖХ иногда назы-

вают «жидкостной хроматографией высокого давления».

В зависимости от механизма разделения веществ различают следую-

щие варианты ВЭЖХ: адсорбционную, распределительную, ионообменную,

эксклюзионную, хиральную и др.

В адсорбционной хроматографии разделение веществ происходит за счет их различной способности адсорбироваться и десорбироваться с по-

верхности адсорбента с развитой поверхностью, например, силикагеля.

В распределительной ВЭЖХ разделение происходит за счет различия коэффициентов распределения разделяемых веществ между неподвижной

(как правило, химически привитой к поверхности неподвижного носителя) и

подвижной фазами.

По полярности ПФ и НФ ВЭЖХ разделяют на нормально-фазовую и об-

ращенно-фазовую.

Нормально-фазовым называют вариант хроматографии, в котором ис-

пользуются полярный сорбент (например, силикагель или силикагель с при-

витыми NH2 - или CN-группами) и неполярная ПФ (например, гексан с раз-

личными добавками). В обращенно-фазовом варианте хроматографии ис-

пользуют неполярные химически модифицированные сорбенты (например,

неполярный алкильный радикал C18 ) и полярные подвижные фазы (например,

метанол, ацетонитрил).

В ионообменной хроматографии молекулы веществ смеси, диссоции-

ровавшие в растворе на катионы и анионы, разделяются при движении через

сорбент (катионит или анионит) за счет их разной скорости обмена с ионны-

ми группами сорбента.

В эксклюзионной (ситовой, гель-проникающей, гель-фильтрационной)

хроматографии молекулы веществ разделяются по размеру за счет их разной способности проникать в поры неподвижной фазы. При этом первыми из ко-

лонки выходят наиболее крупные молекулы (с наибольшей молекулярной массой), способные проникать в минимальное число пор неподвижной фазы,

а последними выходят вещества с малыми размерами м олекул.

Часто разделение протекает не по одному, а по нескольким механи змам одновременно.

Метод ВЭЖХ может применяться для контроля качества любых нега-

зообразных анализируемых веществ. Для проведения анализа используют соответствующие приборы – жидкостные хроматографы.

В состав жидкостного хроматографа обычно входят следующие основ-

ные узлы:

– узел подготовки ПФ, включая емкость с подвижной фазой (или емко-

сти с отдельными растворителями, входящими в состав подвижной фа-

зы) и систему дегазации ПФ;

– насосная система;

– смеситель подвижной фазы (при необходимости);

– система ввода пробы (инжектор);

– хроматографическая колонка (может быть установлена в термостате);

– детектор;

– система сбора и обработки данных.

Насосная система

Насосы обеспечивают подачу ПФ в колонку с заданной постоянной скоростью. Состав подвижной фазы может быть постоянным или меняю-

щимся во время анализа. В первом случае процесс называют изократическим,

а во втором – градиентным. Перед насосной системой иногда устанавливают

фильтры с диаметром пор 0,45 мкм для фильтрации подвижной фазы. Совре-

менная насосная система жидкостного хроматографа состоит из одного или нескольких насосов, управляемых компьютером. Это позволяет менять со-

став ПФ по определенной программе при градиентном элюировании. Сме-

шение компонентов ПФ в смесителе может происходить как при низком дав-

лении (до насосов), так и при высоком давлении (после насосов). Смеситель можно использовать для подготовки ПФ и при изократическом элюировании,

однако более точное соотношение компонентов достигается при предвари-

тельном смешении компонентов ПФ для изократического процесса. Насосы для аналитической ВЭЖХ позволяют поддерживать постоянную скорость подачи ПФ в колонку в интервале от 0,1 до 10 мл/мин при давлении на входе в колонку до 50 МПа. Целесообразно, однако, чтобы это значение не превы-

шало 20 МПа. Пульсации давления минимизируются специальными демп-

ферными системами, входящими в конструкцию насосов. Рабочие детали на-

сосов изготавливаются из коррозионностойких материалов, что позволяет использовать в составе ПФ агрессивные компоненты.

Смесители

По своей конструкции смесители могут быть статическими или дина-

мическими.

В смесителе происходит образование единой подвижной фазы из от-

дельных растворителей, подаваемых насосами, если необходимая смесь не была приготовлена заранее. Смешивание растворителей обычно происходит самопроизвольно, но иногда применяются системы с принудительным сме-

шиванием.

Инжекторы

Инжекторы могут быть универсальными для ввода проб от

1 мкл до 2 мл или дискретными для ввода пробы только определенного объ-

ема. Оба типа инжекторов могут быть автоматическими («автоинжекторы» или «автосэмплеры»). Инжектор для ввода пробы (раствора) расположен не-

посредственно перед хроматографической колонкой. Конструкция инжектора позволяет изменять направление потока ПФ и осуществлять предварительное введение пробы в петлю определенного объема (обычно от 10 до 100 мкл).

Этот объем указан на маркировке петли. Конструкция инжектора позволяет осуществлять замену петли. Для введения анализируемого раствора в неав-

томатический инжектор используется ручной микрошприц с объемом, значи-

тельно превосходящим объем петли. Избыток введенного раствора, не по-

местившийся в петле, сбрасывается, и в колонку вводится точный и всегда одинаковый объем пробы. Ручное неполное заполнение петли снижает точ-

ность и воспроизводимость дозирования и, следовательно, ухудшает точ-

ность и воспроизводимость хроматографического анализа.

Хроматографическая колонка

Хроматографические колонки обычно представляют собой трубки из нержавеющей стали, стекла или пластика, заполненные сорбентом и закры-

тые с обеих сторон фильтрами с диаметром пор 2–5 мкм. Длина аналитиче-

ской колонки в зависимости от механизма хроматографического разделения может находиться в диапазоне от 5 до 60 см и более (обычно она составляет

10–25 см), внутренний диаметр – от 2 до 10 мм (обычно 4,6 мм). Колонки с внутренним диаметром менее 2 мм используются в микроколоночной хрома-

тографии. Используются также капиллярные колонки с внутренним диамет-

ром около 0,3-0,7 мм. Колонки для препаративной хроматографии имеют внутренний диаметр до 50 мм и более.

Перед аналитической колонкой могут устанавливаться короткие ко-

лонки (предколонки) выполняющие различные вспомогательные функции

(чаще – защита аналитической колонки). Обычно анализ проводят при ком-

натной температуре, однако для увеличения эффективности разделения и со-

кращения продолжительности анализа может быть использовано термоста-

тирование колонок при температурах не выше 60 С. При более высоких температурах возможна деструкция сорбента и изменение состава ПФ.

Неподвижная фаза (сорбент)

В качестве сорбентов обычно применяются:

1. Силикагель, оксид алюминия, пористый графит используются в нор-

мально-фазовой хроматографии. Механизм удерживания в данном слу-

чае – обычно адсорбция;

2. Смолы или полимеры с кислотными или основными группами. Область применения – ионообменная хроматография;

3. Пористый силикагель или полимеры (эксклюзионная хроматография);

4. Химически модифицированные сорбенты (сорбенты с привитыми фа-

зами), приготовленные чаще всего на основе силикагеля. Механизм удерживания в большинстве случаев – распределение между подвиж-

ной и неподвижной фазами;

5. Химически модифицированные хиральные сорбенты, например произ-

водные целлюлозы и амилозы, протеины и пептиды, циклодекстрины,

используемые для разделения энантиомеров (хиральная хроматогра-

Сорбенты с привитыми фазами могут иметь различную степень хими-

ческой модификации. Частицы сорбента могут иметь сферическую или не-

правильную форму и разнообразную пористость.

В качестве привитых фаз наиболее часто применяются:

– октильные группы (сорбент октилсилан или С8 );

– октадецильные группы (сорбент октадецилсилан

(ODS) или С18 );

– фенильные группы (сорбент фенилсилан);

– цианопропильные группы (сорбент CN);

– аминопропильные группы (сорбент NH2 );

– диольные группы (сорбент диол).

Наиболее часто анализ выполняют на неполярных привитых фазах в

обращенно-фазовом режиме с применением сорбента С18 .

В некоторых случаях более целесообразно применять нормально-

фазовую хроматографию. При этом используют силикагель или полярные привитые фазы («CN», «NH2 », «диол») в сочетании с неполярными раствори-

Сорбенты с привитыми фазами химически устойчивы при значениях pH от 2,0 до 8,0, если другое специально не оговаривается производителем.

Частицы сорбента могут иметь сферическую или неправильную форму и разнообразную пористость. Размер частиц сорбента в аналитической ВЭЖХ обычно составляет 3–10 мкм, в препаративной ВЭЖХ – до 50 мкм и более.

Используются также монолитные сорбенты.

Высокая эффективность разделения обеспечивается высокой площадью поверхности частиц сорбента (которая является следствием их микроскопи-

ческих размеров и наличия пор), а также равномерностью состава сорбента и плотной и равномерной его упаковкой.

Детекторы

Используются различные способы детектирования. В общем случае ПФ с растворенными в ней компонентами после хроматографической колон-

ки попадает в ячейку детектора, где непрерывно измеряется то или иное ее свойство (поглощение в УФ или видимой области спектра, флуоресценция,

показатель преломления, электропроводность и др.). Полученная при этом хроматограмма представляет собой график зависимости некоторого физиче-

ского или физико-химического параметра ПФ от времени.

Наиболее распространенными являются спектрофотометрические де-

текторы (включая диодно-матричные), регистрирующие изменение оптиче-

ской плотности в ультрафиолетовой, видимой и часто в ближней инфракрас-

ной областях спектра от 190 до 800 или 900 нм. Хроматограмма в этом слу-

чае представляет собой зависимость оптической плотности ПФ от времени.

Традиционно используемый спектрофотометрический детектор позво-

ляет проводить детектирование при любой длине волны в его рабочем диапа-

зоне. Применяются также мультиволновые детекторы, позволяющие прово-

дить детектирование при нескольких длинах волн одновременно.

С помощью диодно-матричного детектора можно не только проводить детектирование сразу по нескольким длинам волн, но и практически мгно-

венно (без сканирования) получать оптический спектр ПФ в любой момент времени, что значительно упрощает качественный анализ разделяемых ком-

понентов.

Чувствительность флуоресцентных детекторов примерно в 1000 раз выше чувствительности спектрофотометрических. При этом используется либо собственная флуоресценция, либо флуоресценция соответствующих производных, если само определяемое вещество не флуоресцирует. Совре-

менные флуоресцентные детекторы позволяют не только получать хромато-

граммы, но и регистрировать спектры возбуждения и флуоресценции анали-

зируемых соединений.

Для анализа образцов, не поглощающих в УФ и видимой областях спектра (например, углеводов), используют рефрактометрические детекторы

(рефрактометры). Недостатки этих детекторов – их низкая (по сравнению со спектрофотометрическими детекторами) чувствительность и значительная температурная зависимость интенсивности сигнала (детектор необходимо термостатировать).

Используются также электрохимические детекторы (кондуктометриче-

ские, амперометрические и др.), масс-спектрометрические и Фурье-ИК-

детекторы, детекторы светорассеивания, радиоактивности и некоторые дру-

Подвижная фаза

В качестве ПФ могут применяться разнообразные растворители – как индивидуальные, так и их смеси.

В нормально-фазовой хроматографии обычно применяются жидкие уг-

леводороды (гексан, циклогексан, гептан) и другие относительно неполярные

растворители с небольшими добавками полярных органических соединений,

которые регулируют элюирующую силу ПФ.

В обращено-фазовой хроматографии в состав ПФ входят полярные ор-

ганические растворители (обычно ацетонитрил и метанол) и вода. Для опти-

мизации разделения часто используют водные растворы с определенным зна-

чением рН, в частности буферные растворы. Применяют добавки неоргани-

ческих и органических кислот, оснований и солей и другие соединения (на-

пример, хиральные модификаторы для разделения энантиомеров на ахираль-

ном сорбенте).

Контроль значения рН необходимо осуществлять отдельно для водного компоненента, а не для его смеси с органическим растворителем.

ПФ может состоять из одного растворителя, часто из двух, при необхо-

димости – из трех и более. Состав ПФ указывают как объемное соотношение входящих в нее растворителей. В отдельных случаях может указываться мас-

совое соотношение, что должно быть специально оговорено.

При использовании УФ-спектрофотометрического детектора ПФ не должна иметь выраженного поглощения при выбранной для детектирования длине волны. Предел прозрачности или оптическая плотность при опреде-

ленной длине волны растворителя конкретного изготовителя часто указыва-

ется на упаковке.

На хроматографический анализ большое влияние оказывает степень чистоты ПФ, поэтому предпочтительно применять растворители, выпущен-

ные специально для жидкостной хроматографии (включая воду).

ПФ и анализируемые растворы не должны содержать нерастворивших-

ся частиц и пузырьков газа. Воду, полученную в лабораторных условиях,

водные растворы, предварительно смешанные с водой органические раство-

рители, а также анализируемые растворы необходимо подвергать тонкой фильтрации и дегазации. Для этих целей обычно применяют фильтрование

под вакуумом через инертный по отношению к данному растворителю или раствору мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм.

Система сбора и обработки данных

Современная система обработки данных представляет собой сопря-

женный с хроматографом персональный компьютер с установленным про-

граммным обеспечением, позволяющим регистрировать и обрабатывать хро-

матограмму, а также управлять работой хроматографа и следить за основны-

ми параметрами хроматографической системы.

Перечень условий хроматографирования, подлежащих указанию

В частной фармакопейной статье должны быть приведены размеры ко-

лонки, тип сорбента с указанием размера частиц, температура колонки (если необходимо термостатирование), объем вводимой пробы (объем петли), со-

став ПФ и способ ее приготовления, скорость подачи ПФ, детектор и усл овия детектирования, описание градиентного режима (если используется), время хроматографирования.

ИОНООБМЕННАЯ И ИОННАЯ ВЭЖХ

Ионообменная хроматография используется для анализа как органиче-

ских (гетероциклические основания, аминокислоты, белки и др.), так и неор-

ганических (различные катионы и анионы) соединений. Разделение компо-

нентов анализируемой смеси в ионообменной хроматографии основано на обратимом взаимодействии ионов анализируемых веществ с ионными груп-

пами сорбента. В качестве сорбентов используются аниониты или катиони-

ты. Эти сорбенты представляют собой, в основном, либо полимерные ионо-

обменные смолы (обычно сополимеры стирола и дивинилбензола с приви-

тыми ионными группами), либо силикагели с привитыми ионообменными группами. Сорбенты с группами -(СН2 )3 N+ Х– используются для разделения анионов, а сорбенты с группами -(СН2 )SО3 – Н+ – для разделения катионов.

Обычно для разделения анионов применяют полимерные смолы, а для разд е-

ления катионов – модифицированные силикагели.

В качестве ПФ в ионообменной хроматографии применяют водные растворы кислот, оснований и солей. Обычно используются буферные рас-

творы, позволяющие поддерживать определенные значения рН. Возможно также использование небольших добавок смешивающихся с водой органиче-

ских растворителей – ацетонитрила, метанола, этанола, тетрагидрофурана.

Ионная хроматография - вариант ионообменной хроматографии, в

котором для определения концентрации ионов анализируемого вещества ис-

пользуется кондуктометрический детектор. Для высокочувствительного оп-

ределения изменений электропроводности проходящей через детектор ПФ фоновая электропроводность ПФ должна быть низкой.

Существуют два основных варианта ионной хроматографии.

Первый из них основан на подавлении электропроводности электроли-

та ПФ с помощью второй ионообменной колонки, находящейся между ана-

литической колонкой и детектором. В этой колонке происходит нейтрализа-

ция ПФ и анализируемые соединения попадают в ячейку детектора в деиони-

зированной воде. Детектируемые ионы являются единственными ионами,

обеспечивающими проводимость ПФ. Недостаток подавляющей колонки – необходимость ее регенерации через достаточно короткие промежутки вре-

мени. Подавляющая колонка может быть заменена непрерывно действую-

щим мембранным подавителем, в котором состав мембраны непрерывно об-

новляется потоком регенерирующего раствора, движущегося в направлении,

противоположном направлению потока ПФ.

Второй вариант ионной хроматографии – одноколоночная ионная хро-

матография. В этом варианте используется ПФ с очень низкой электропро-

водностью. В качестве электролитов широко применяют слабые органиче-

ские кислоты – бензойную, салициловую или изофталевую.

ЭКСКЛЮЗИОННАЯ ВЭЖХ

Эксклюзионная хроматография (гель-хроматография) – особый вариант ВЭЖХ, основанный на разделении молекул по их размерам. Распределение

молекул между неподвижной и подвижной фазами основано на размерах мо-

лекул и частично на их форме и полярности. Для разделения используют по-

ристые сорбенты – полимеры, силикагель, пористые стекла и полисахариды.

Размер частиц сорбентов 5–10 мкм.

Преимуществами пористых стекол и силикагеля являются быстрая диффузия ПФ и молекул анализируемого вещества в поры, устойчивость в различных условиях (даже при высоких температурах). Полимерные сорбен-

ты представляют собой сополимеры стирола и дивинилбензола (это гидро-

фобные сорбенты, используемые с неполярными подвижными фазами) и

гидрофильные гели, получаемые из сульфированного дивинилбензола или полиакриламидных смол.

Возможны два предельных типа взаимодействия молекул с пористой неподвижной фазой. Молекулы, размер которых больше среднего диаметр а пор, вообще не проникают в сорбент и элюируются вместе с подвижной фа-

зой первыми. Молекулы с диаметром значительно меньше размера пор сор-

бента свободно проникают в него, остаются в неподвижной фазе наибольшее время и элюируются последними. Молекулы средних размеров проникают в поры сорбента в зависимости от размера и частично в зависимости от своей формы. Они элюируются с различными временами удерживания между са-

мыми крупными и самыми мелкими молекулами. Разделение компонентов хроматографируемого образца происходит в результате повторяющихся ак-

тов диффузии компонентов образца в поры сорбента, и обратно.

В эксклюзионной хроматографии для характеристики удерживания ис-

пользуется объем удерживания, равный произведению скорости потока ПФ на время удерживания.

Подвижная фаза. Выбор ПФ зависит от типа сорбента. Эксклюзион-

ная хроматография в целом делится на гель-фильтрационную и гель-

проникающую хроматографию.

Метод гель-фильтрационной хроматографии используют для разделе-

ния водорастворимых соединений на гидрофильных сорбентах. Подвижные фазы представляют собой водные буферные растворы с заданным значением рН.

В гель-проникающей хроматографии применяются гидрофобные сор-

бенты и неполярные органические растворители (толуол, дихлорметан, тет-

рагидрофуран). Этот метод используют для анализа соединений, малораство-

римых в воде.

Детекторы. В качестве детекторов в эксклюзионной хроматографии используются дифференциальные рефрактометрические детекторы, а также спектрофотометрические детекторы (в том числе, в ИК-области спектра).

Применяются также вискозиметрический и проточный лазерный детекторы.

Эти детекторы в комбинации с рефрактометром или другим концентрацион-

ным детектором позволяют непрерывно определять молекулярную массу по-

лимера в ПФ.

УЛЬТРАЭФФЕКТИВНАЯ ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Ультраэффективная жидкостная хроматография представляет собой вариант жидкостной хроматографии, отличающийся большей эффективно-

стью по сравнению с классической ВЭЖХ.

Особенностью ультраэффективной жидкостной хроматографии являет-

ся использование сорбентов с размером частиц от 1,5 до 2 мкм. Размеры хро-

матографических колонок обычно составляют от 50 до 150 мм в длину и от 1

до 4 мм в диаметре. Объем вводимой пробы может составлять от 1 до 50 мкл.

Хроматографическое оборудование, используемое в классическом ва-

рианте ВЭЖХ, обычно специально адаптировано для этого вида хроматогра-

Оборудование, предназначенное для ультраэффективной жидкостной хроматографии, может использоваться и в классическом варианте ВЭЖХ.

Жидкостно-адсорбционная хроматография на колонке

Разделение смеси веществ в адсорбционной колонке происходит в результате различия их в сорбируемости на данном адсорбенте (в соответствии с законом адсорбционного замещения, установленного М. С. Цветом).

Адсорбентами являются пористые тела с сильно развитой внутренней поверхностью, удерживающие жидкости с помощью межмолекулярных и поверхностных явлений. Это могут быть полярные и неполярные неорганические и органические соединения. К полярным адсорбентам относятся силикагель (высушенная желатинообразная двуокись кремния), оксид алюминия, карбонат кальция, целлюлоза, крахмал и др. Неполярные сорбенты - активированный уголь, порошок резины и множество других, полученных синтетическим путем.

К адсорбентам предъявляют следующие требования: S они не должны вступать в химические реакции с подвижной фазой и разделяемыми веществами; S должны обладать механической прочностью; S зерна адсорбента должны быть одинаковой степени дисперсности.

При выборе условий для хроматографического процесса учитывают свойства адсорбента и адсорбируемых веществ.

В классическом варианте жидкостной колоночной хроматографии (ЖКХ) через хроматографическую колонку, представляющую собой стеклянную трубку диаметром 0,5 - 5 см и длиной 20 - 100 см, заполненную сорбентом (НФ), пропускают элюент (ПФ). Элюент движется под воздействием силы тяжести. Скорость его движения можно регулировать имеющимся внизу колонки краном. Анализируемую смесь помещают в верхнюю часть колонки. По мере продвижения пробы по колонке происходит разделение компонентов. Через определенные промежутки времени отбирают фракции выделившегося из колонки элюента, который анализируют каким-либо методом, позволяющим измерять концентрации определяемых веществ.

Колоночная адсорбционная хроматография в настоящее время применяется, главным образом не как самостоятельный метод анализа, а как способ предварительного (иногда и конечного) разделения сложных смесей на более простые, т.е. для подготовки к анализу другими методами (в том числе и хроматографическими). Например, на колонке с окисью алюминия разделяют смесь токоферолов, пропускают элюент и собирают фракцию а-токоферола для последующего определения фотометрическим методом.

Хроматографическое разделение смеси на колонке вследствие медленного продвижения ПФ занимает много времени. Для ускорения процесса хроматографирование проводят под давлением. Этот метод называют высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЖХ)

Модернизация аппаратуры, применяемой в классической жидкостной колоночной хроматографии, сделала ее одним из перспективных и современных методов анализа. Высокоэффективная жидкостная хроматография является удобным способом разделения, препаративного выделения и проведения качественного и количественного анализа нелетучих термолабильных соединений как с малой, так с большой молекулярной массой.

В зависимости от типа применяемого сорбента в данном методе используют 2 варианта хроматографирования: на полярном сорбенте с использованием неполярного элюента (вариант прямой фазы) и на неполярном сорбенте с использованием полярного элюента - так называемая об-ращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография (Оф ВЖХ).

При переходе элюента к элюенту равновесие в условиях ОфВЖХ устанавливается во много раз быстрее, чем в условиях полярных сорбенгов и неводных ПФ. Вследствие этого, а также удобства работы с водными и водно-спиртовыми элюентами, ОфВЖХ получила в настоящее время большую популярность. Большинство анализов при помощи ВЖХ проводят именно этим методом.

Аппаратура для ВЖХ

Комплект современного оборудования для ВЖХ, как правило, состоит из двух насосов 3,4 (рис. 7.1.1.1), управляемых микропроцессором 5, и подающих элюент по определенной программе. Насосы создают давление до 40 МПа. Проба вводится через специальное устройство (инжектор) 7 непосредственно в поток элюента. После прохождения через хроматографическую колонку 8 вещества детектируются высокочувствительным проточным детектором 9, сигнал которого регистрируется и обрабатывается микро-ЭВМ 11. При необходимости, в момент выхода пика автоматически отбираются фракции.

Колонки для ВЖХ выполняют из нержавеющей стали с внутренним диаметром 2 - 6 мм и длиной 10-25 см. Колонки заполняют сорбентом (НФ). В качестве НФ используются силикагель, оксид алюминия или модифицированные сорбенты. Модифицируют обычно силикагель, внедряя химическим путем в его поверхность различные функциональные группы.

Детекторы. Регистрация выхода из колонки отдельного компонента производится с помощью детектора. Для регистрации можно использовать изменение любого аналитического сигнала, идущего от подвижной фазы и связанного с природой и количеством компонента смеси. В жидкостной хроматографии используют такие аналитические сигналы, как светопоглощение или светоиспускание выходящего раствора (фотометрические и флуориметрические детекторы), показатель преломления (рефрактометрические детекторы), потенциал и электрическая проводимость (электрохимические детекторы) и др.

Непрерывно детектируемый сигнал регистрируется самописцем. Хро-матограмма представляет собой зафиксированную на ленте самописца последовательность сигналов детектора, вырабатываемых при выходе из колонки отдельных компонентов смеси. В случае разделения смеси на внешней хроматограмме видны отдельные пики. Положение пика на хромато-грамме используют для целей идентификации вещества, высоту или площадь пика - для целей количественного определения.

Качественный анализ

Важнейшие характеристики хроматограммы - время удерживания tR и связанный с ней удерживаемый объем - отражают природу веществ, их способность к сорбции на материале неподвижной фазы и, следовательно, при постоянстве условий хроматографирования являются средством идентификации вещества. Для данной колонки с определенными скоростью потока и температурой время удерживания каждого соединения постоянно (рис.7.1.1.2), где t.R(A) - время удерживания компонента А анализируемой смеси с момента ввода в колонку до появления на выходе из колонки максимума пика, 1К(вс) - время удерживания внутреннего стандарта (первоначально отсутствующее в анализируемой смеси вещество), h - высота пика (мм), аш - ширина пика на половине его высоты, мм.

Для идентификации вещества по хроматограмме обычно используют стандартные образцы или чистые вещества. Сравнивают время удерживания неизвестного компонента IR* с временем удерживания IRCT известных веществ. Но более надежна идентификация по измерению относительного времени удерживания

При этом в колонку сначала вводят известное вещество (внутренний стандарт) и измеряют время его удерживания tR(Bc), затем хроматографиче-ски разделяют (хроматографируют) исследуемую смесь, в которую предварительно добавляют внутренний стандарт. Относительное время удерживания определяют по формуле (7.1.1.1).

Количественный анализ

В основе этого анализа лежит зависимость высоты пика h или его площади S от количества вещества. Для узких пиков предпочтительнее измерение h, для широких размытых - S. Площадь пика измеряют разными способами: умножением высоты пика (h) на его ширину (ai/2), измеренную на половине его высоты (рис.7.2.3); планиметрированием; с помощью интегратора. Электрическими или электронными интеграторами снабжены современные хроматографы.

Для определения содержания веществ в пробе используют в основном три метода: метод абсолютной градуировки, метод внутренней нормализации и метод внутреннего стандарта.

Метод абсолютной градуировки основан на предварительном определении зависимости между количеством введенного вещества и площадью или высотой пика на хроматограмме. В хроматограмму вводят известное количество градуировочной смеси и определяют площади или высота полученных пиков. Строят график зависимости площади или высоты пика от количества введенного вещества. Анализируют исследуемый образец, измеряют площадь или высоту пика определяемого компонента и на основании градировочного графика рассчитывают его количество.

Этот метод дает информацию только об относительном содержании компонента в смеси, но не позволяет определить его абсолютную величину.

Метод внутреннего стандарта основан на сравнении выбранного параметра пика анализируемого вещества с тем же параметром стандартного вещества, введенного в пробу в известном количестве. В исследуемую пробу вводят известное количество такого стандартного вещества, пик которого достаточно хорошо отделяется от пиков компонентов исследуемой смеси

В последних двух методах требуется введение поправочных коэффициентов, характеризующих чувствительность используемых детекторов к анализируемым веществам. Для разных типов детекторов и разных веществ коэффициент чувствительности определяется экспериментально.

В жидкостной адсорбционной хроматографии используется также анализ фракций растворов, собранных в момент выхода вещества из колонки. Анализ может быть проведен различными физико-химическими методами.

Жидкостную адсорбционную хроматографию применяют в первую очередь для разделения органических веществ. Этим методом весьма успешно изучают состав нефти, углеводородов, эффективно разделяют-транс- и цис- изомеры, алкалоиды и др. С помощью ВЖХ можно определять красители, органические кислоты, аминокислоты, сахара, примеси пестицидов и гербицидов, лекарственных веществ и других загрязнителей в пищевых продуктах.

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Взамен ст. ГФ XI

Высокоэффективная жидкостная хроматография (жидкостная хроматография высокого давления) – это метод колоночной хроматографии, в котором подвижной фазой служит жидкость, движущаяся через хроматографическую колонку, заполненную неподвижной фазой (сорбентом). Колонки для высокоэффективной жидкостной хроматографии характеризуются высоким гидравлическим сопротивлением на входе.

В зависимости от механизма разделения веществ различают следующие варианты высокоэффективной жидкостной хроматографии: адсорбционную, распределительную, ионообменную, эксклюзионную, хиральную и др. в соответствии с характером основных проявляющихся межмолекулярных взаимодействий. В адсорбционной хроматографии разделение веществ происходит за счет их различной способности адсорбироваться и десорбироваться с поверхности сорбента с развитой поверхностью, например, силикагеля. В распределительной высокоэффективной жидкостной хроматографии разделение происходит за счет различия коэффициентов распределения разделяемых веществ между неподвижной (как правило, химически привитой к поверхности неподвижного носителя) и подвижной фазами.

В зависимости от типа подвижной и неподвижной фазы различают нормально-фазовую и обращенно-фазовую хроматографию. В нормально-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии неподвижная фаза – полярная (чаще всего силикагель или силикагель с привитыми NH 2 — или CN-группами и др.), а подвижная фаза – неполярная (гексан, либо смеси гексана с более полярными органическими растворителями – хлороформом, спиртами и т.д.). Удерживание веществ растет с увеличением их полярности. В нормально-фазовой хроматографии элюирующая способность подвижной фазы увеличивается с ростом ее полярности.

В обращенно-фазовой хроматографии неподвижная фаза – неполярная (гидрофобные силикагели с привитыми группами С4, С8, С18 и др.); подвижная фаза – полярная (смеси воды и полярных растворителей: ацетонитрила, метанола, тетрагидрофурана и др.). Удерживание веществ растет с увеличением их гидрофобности (неполярности). Чем больше содержание органического растворителя, тем выше элюирующая способность подвижной фазы.

В ионообменной хроматографии молекулы веществ смеси, диссоциированные в растворе на катионы и анионы, разделяются при движении через сорбент (катионит или анионит) за счет различной силы взаимодействия определяемых ионов с ионными группами сорбента.

В эксклюзионной (ситовой, гель-проникающей, гель-фильтрационной) хроматографии молекулы веществ разделяются по размеру за счет их разной способности проникать в поры неподвижной фазы. При этом первыми из колонки выходят наиболее крупные молекулы, способные проникать в минимальное число пор неподвижной фазы, а последними выходят вещества с малыми размерами молекул.

В хиральной хроматографии происходит разделение оптически активных соединений на отдельные энантиомеры. Разделение может осуществляется на хиральных неподвижных фазах или на ахиральных неподвижных фазах с использованием хиральных подвижных фаз.

Существуют и другие варианты высокоэффективной жидкостной хроматографии.

часто разделение протекает не по одному, а по нескольким механизмам одновременно, в зависимости от типа подвижной и неподвижной фаз, а также природы определяемого соединения.

Область применения

Высокоэффективная жидкостная хроматография успешно применяется как для качественного, так и для количественного анализа лекарственных средств в испытаниях «Подлинность», «Посторонние примеси», «Растворение», «Однородность дозирования», «Количественное определение». Следует отметить, что хроматография позволяет совмещать в одной пробе несколько испытаний, в том числе «Подлинность» и «Количественное определение».

Оборудование

Для проведения анализа используют соответствующие приборы – жидкостные хроматографы.

В состав жидкостного хроматографа обычно входят следующие основные узлы:

— узел подготовки подвижной фазы, включая емкость с подвижной фазой (или емкости с отдельными растворителями, входящими в состав подвижной фазы) и систему дегазации подвижной фазы;

— насосная система;

— смеситель подвижной фазы (при необходимости);

— система ввода пробы (инжектор), может быть ручным или автоматическим (автосамплер);

— хроматографическая колонка (может быть установлена в термостате);

— детектор (один или несколько с разными способами детектирования);

— система управления хроматографом, сбора и обработки данных.

Помимо этого в состав хроматографа могут входить: система пробоподготовки и предколоночный реактор, система переключения колонок, постколоночный реактор и другое оборудование.

Насосная система

Насосы обеспечивают подачу подвижной фазы в колонку с заданной скоростью. Состав подвижной фазы и скорость потока могут быть постоянными или меняющимся во время анализа. В случае постоянного состава подвижной фазы процесс называют изократическим, а во втором – градиентным. Современная насосная система жидкостного хроматографа состоит из одного или нескольких насосов, управляемых компьютером. Это позволяет менять состав подвижной фазы по определенной программе при градиентном элюировании. Насосы для аналитической высокоэффективной жидкостной хроматографии позволяют поддерживать скорость подачи подвижной фазы в колонку в интервале от 0,1 до 10 мл/мин при давлении на входе в колонку до 40 МПа. Пульсации давления минимизируются специальными демпферными системами, входящими в конструкцию насосов. Рабочие детали насосов изготавливаются из коррозионностойких материалов, что позволяет использовать в составе подвижной фазы агрессивные компоненты.

Смесители

В смесителе происходит образование единой подвижной фазы из отдельных растворителей, подаваемых насосами, если необходимая смесь не была приготовлена заранее. Смешение компонентов подвижной фазы в смесителе может происходить как при низком давлении (до насосов), так и при высоком давлении (после насосов). Смеситель можно использовать для подготовки подвижной фазы и при изократическом элюировании.

Объем смесителя может влиять на время удерживания компонентов при градиентном элюировании.

Инжекторы

Инжекторы могут быть универсальными, с возможностью изменения объема вводимой пробы, или дискретными для ввода пробы только определенного объема. Оба типа инжекторов могут быть автоматическими («автоинжекторы» или «автосэмплеры»). Инжектор для ввода пробы (раствора) расположен непосредственно перед хроматографической колонкой. Конструкция инжектора позволяет изменять направление потока подвижной фазы и осуществлять предварительное введение пробы в петлю-дозатор определенного объема (обычно от 10 до 100 мкл) или в специальное дозирующее устройство переменного объема. Объем петли указан на ее маркировке. Конструкция дискретного инжектора, как правило, позволяет осуществлять замену петли. Современные автоматические инжекторы могут обладать рядом дополнительных функций, например, выполнять функцию станции пробоподготовки: осуществлять смешение и разбавление образцов, проводить реакцию предколоночной дериватизации.

Хроматографическая колонка

Хроматографические колонки обычно представляют собой трубки из нержавеющей стали, стекла или пластика, заполненные сорбентом и закрытые с обеих сторон фильтрами с диаметром пор 2–5 мкм. Длина аналитической колонки может находиться в диапазоне от 5 до 60 см и более, внутренний диаметр – от 2 до 10 мм. Колонки с внутренним диаметром менее 2 мм используются в микроколоночной хроматографии. Существуют также капиллярные колонки с внутренним диаметром около 0,3–0,7 мм. Колонки для препаративной хроматографии могут иметь внутренний диаметр 50 мм и более.

Перед аналитической колонкой могут устанавливаться короткие колонки (предколонки), выполняющие различные вспомогательные функции, основная из которых — защита аналитической колонки. Обычно анализ проводят при комнатной температуре, однако для увеличения эффективности разделения и сокращения продолжительности анализа может быть использовано термостатирование колонок при температурах до 80 — 100 °С. Возможность использования повышенной температуры при разделении ограничивается стабильностью неподвижной фазы, поскольку при повышенных температурах возможна ее деструкция.

Неподвижная фаза (сорбент)

В качестве сорбентов обычно применяются:

• силикагель, оксид алюминия, используются в нормально-фазовой хроматографии. Механизм удерживания в данном случае – обычно адсорбция;
• силикагель, смолы или полимеры с привитыми кислотными или основными группами. Область применения – ионообменная и ионная хроматография;
• силикагель или полимеры с заданным распределением размеров пор (эксклюзионная хроматография);
• химически модифицированные сорбенты (сорбенты с привитыми фазами), приготовленные чаще всего на основе силикагеля. Механизм удерживания ‑ адсорбция или распределение между подвижной и неподвижной фазами. Область применения зависит от типа привитых функциональных групп. Некоторые типы сорбентов могут использоваться как в обращенной, так и в нормально фазовой хроматографии;
• химически модифицированные хиральные сорбенты, например, производные целлюлозы и амилозы, протеины и пептиды, циклодекстрины, хитозаны, используемые для разделения энантиомеров (хиральная хроматография).

Сорбенты с привитыми фазами могут иметь различную степень химической модификации. В качестве привитых фаз наиболее часто применяются:

– октадецильные группы (сорбент октадецилсилан (ODS) или С 18);

– октильные группы (сорбент октилсилан или С 8);

– фенильные группы (сорбент фенилсилан);

– цианопропильные группы (сорбент CN);

– аминопропильные группы (сорбент NH 2);

– диольные группы (сорбент диол).

Наиболее часто анализ выполняют на неполярных привитых фазах в обращенно-фазовом режиме с применением сорбента С 18 .

Сорбенты с привитыми фазами, полученные на основе силикагеля, химически устойчивы при значениях pH от 2,0 до 7,0, если другое специально не оговаривается производителем. Частицы сорбента могут иметь сферическую или неправильную форму и разнообразную пористость. Размер частиц сорбента в аналитической высокоэффективной жидкостной хроматографии обычно составляет 3–10 мкм, в препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии – 50 мкм и более. Существуют также монолитные колонки, в которых сорбент представляет собой монолит со сквозными порами, заполняющий весь объем колонки.

Высокая эффективность разделения обеспечивается высокой площадью поверхности частиц сорбента (которая является следствием их микроскопических размеров и наличия пор), а также равномерностью состава сорбента и плотной и равномерной его упаковкой.

Детекторы

В высокоэффективной жидкостной хроматографии используются различные способы детектирования. В общем случае подвижная фаза с растворенными в ней компонентами после хроматографической колонки попадает в ячейку детектора, где непрерывно измеряется то или иное ее свойство (поглощение в ультрафиолетовой или видимой области спектра, флуоресценция, показатель преломления, электропроводность и др.). Полученная при этом хроматограмма представляет собой график зависимости некоторого физического или физико-химического параметра подвижной фазы от времени.

Наиболее распространенными детекторами в высокоэффективной жидкостной хроматографии являются спектрофотометрические. В процессе элюирования веществ в специально сконструированной микрокювете измеряется оптическая плотность элюата при заранее выбранной длине волны. Широкая область линейности детектора позволяет анализировать как примеси, так и основные компоненты смеси на одной хроматограмме. Спектрофотометрический детектор позволяет проводить детектирование при любой длине волны в его рабочем диапазоне (как правило, 190-600 нм). Применяются также мультиволновые детекторы, позволяющие проводить детектирование при нескольких длинах волн одновременно и детекторы на диодной матрице, позволяющие регистрировать оптическую плотность одновременно во всем рабочем диапазоне длин волн (как правило, 190-950 нм). Это позволяет регистрировать спектры поглощения проходящих через ячейку детектора компонентов.

Флуориметрический детектор применяется для определения флуоресцирующих соединений или не флуоресцирующих соединений в виде их флуоресцирующих производных. Принцип действия флуориметрического детектора основан на измерении флуоресцентного излучения поглощенного света. Поглощение обычно проводят в ультрафиолетовой области спектра, длины волн флуоресцентного излучения превышают длины волн поглощенного света. Флуориметрические детекторы обладают очень высокой чувствительностью и селективностью. Чувствительность флуоресцентных детекторов примерно в 1000 раз выше чувствительности спектрофотометрических. Современные флуоресцентные детекторы позволяют не только получать хроматограммы, но и регистрировать спектры возбуждения и флуоресценции анализируемых соединений.

Для определения соединений, слабо поглощающих в ультрафиолетовой и видимой областях спектра (например углеводов), используют рефрактометрические детекторы (рефрактометры). Недостатки этих детекторов – их низкая (по сравнению со спектрофотометрическими детекторами) чувствительность и значительная температурная зависимость интенсивности сигнала (детектор необходимо термостатировать), а также невозможность их использование в режиме градиентного элюирования.

Принцип работы испарительных детекторов лазерного светового рассеяния основан на различии давлений паров хроматографических растворителей, входящих в состав подвижной фазы, и анализируемых веществ. Подвижная фаза на выходе из колонки вводится в распылитель, смешивается с азотом или СО 2 и в виде мелкодисперсного аэрозоля попадает в обогреваемую испарительную трубку с температурой 30 – 160 °С, в которой подвижная фаза испаряется. Аэрозоль из нелетучих частиц анализируемых веществ рассеивает световой поток в камере рассеивания. По степени рассеивания светового потока можно судить о количестве определяемого соединения. Детектор более чувствителен, чем рефрактометрический, его сигнал не зависит от оптических свойств пробы, от типа функциональных групп в определяемых веществах, от состава подвижной фазы и может быть использован в режиме градиентного элюирования.

Электрохимические детекторы (кондуктометрические, амперометрические, кулонометрические и др.). Амперометрический детектор применяют для определения электроактивных соединений, которые могут быть окислены или восстановлены на поверхности твердого электрода. Аналитическим сигналом является величина тока окисления или восстановления. В ячейке детектора имеется по крайне мере два электрода – рабочий и электрод сравнения (хлоридсеребрянный или стальной). К электродам прикладывается рабочий потенциал, величина которого зависит от природы определяемых соединений. Измерения могут проводиться как при постоянном потенциале, так и в импульсном режиме, когда задается профиль изменения потенциала рабочего электрода в течении одного цикла регистрации сигнала. В амперометрическом детекторе используют рабочие электроды из углеродных материалов (наиболее часто стеклоуглеродный или графитовый), и металлические: платиновый, золотой, медный, никелевый.

Кондуктометрический детектор используют для детектирования анионов и катионов в ионной хроматографии. Принцип его работы основан на измерении электропроводности подвижной фазы в процессе элюирования вещества.

Исключительно информативным является масс-спектрометрический детектор, который обладает высокой чувствительностью и селективностью. Последние модели масс-спектрометров для жидкостной хроматографии работают в диапазоне масс m/z от 20 до 4000 а.е.м.

В высокоэффективной жидкостной хроматографии используются также, Фурье-ИК-детекторы, радиоактивности и некоторые другие.

Система сбора и обработки данных

Современная система обработки данных представляет собой сопряженный с хроматографом персональный компьютер с установленным программным обеспечением, позволяющим регистрировать и обрабатывать хроматограмму, а также управлять работой хроматографа и следить за основными параметрами хроматографической системы.

Подвижная фаза

Подвижная фаза в высокоэффективной жидкостной хроматографии выполняет двоякую функцию: обеспечивает перенос десорбированных молекул по колонке и регулирует константы равновесия, а, следовательно, и удерживание в результате взаимодействия с неподвижной фазой (сорбируясь на поверхности) и с молекулами разделяемых веществ. Таким образом, изменяя состав подвижной фазы в высокоэффективной жидкостной хроматографии можно влиять на времена удерживания соединений, селективность и эффективность их разделения.

Подвижная фаза может состоять из одного растворителя, часто из двух, при необходимости – из трех и более. Состав подвижной фазы указывают как объемное соотношение входящих в нее растворителей. В отдельных случаях может указываться массовое соотношение, что должно быть специально оговорено. В качестве компонентов подвижной фазы могут быть использованы буферные растворы с определенным значением рН, различные соли, кислоты и основания и другие модификаторы.

В нормально-фазовой хроматографии обычно применяются жидкие углеводороды (гексан, циклогексан, гептан) и другие относительно неполярные растворители с небольшими добавками полярных органических соединений, которые регулируют элюирующую силу подвижной фазы.

В обращено-фазовой хроматографии в качестве подвижной фазы используется вода или водно-органические смеси. Органическими добавками обычно служат полярные органические растворители (ацетонитрил и метанол). Для оптимизации разделения могут использоваться водные растворы с определенным значением рН, в частности буферные раствор, а также различные добавки в подвижную фазу: фосфорная и уксусная кислоты при разделении соединений кислотного характера; аммиак и алифатические амины при разделении соединений основного характера, и другие модификаторы.

На хроматографический анализ большое влияние оказывает степень чистоты подвижной фазы, поэтому предпочтительно применять растворители, выпущенные специально для жидкостной хроматографии (включая воду).

При использовании УФ-спектрофотометрического детектора подвижная фаза не должна иметь выраженного поглощения при выбранной для детектирования длине волны. Предел прозрачности или оптическая плотность при определенной длине волны растворителя конкретного изготовителя часто указывается на упаковке.

Подвижная фаза и анализируемые растворы не должны содержать нерастворившиеся частиц и пузырьки газа. Воду, полученную в лабораторных условиях, водные растворы, предварительно смешанные с водой органические растворители, а также анализируемые растворы необходимо подвергать тонкой фильтрации и дегазации. Для этих целей обычно применяют фильтрование под вакуумом через инертный по отношению к данному растворителю или раствору мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм

Перечень условий хроматографирования, подлежащих указанию

В фармакопейной статье должны быть приведены: полное коммерческое наименование колонки с указанием производителя и каталожного номера, размеры колонки (длина и внутренний диаметр), типа сорбента с указанием размера частиц, размера пор, температура колонки (если необходимо термостатирование), объем вводимой пробы (объем петли), состав подвижной фазы и способ ее приготовления, скорость подачи подвижной фазы, тип детектора и условия детектирования (при необходимости параметры используемой ячейки детектора), описание градиентного режима (если используется), включающее в себя стадию переуравновешивания к исходным условиям, время хроматографирования, подробное описание методики и формулы расчета, описания приготовления стандартных и испытуемых растворов.

В случае использования предколоночной дериватизации в автосамплере приводится информацию о программе работы автосамплера. В случае использования постколоночной дериватизации указывается скорость подачи дериватизирующего реагента, объем петли смешения и ее температура.

Модифицированные виды высокоэффективной жидкостной хроматографии

Ион-парная хроматография

Одной из разновидностей обращено-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии является ион парная хроматография – позволяющая определять ионизированные соединения. Для этого в состав традиционной обращено-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии подвижной фазы добавляют гидрофобные органические соединения с ионогенными группами (ион парные реагенты). Для разделения оснований обычно используют алкилсульфаты натрия, для разделения кислот применяют соли тетраалкиламмония (тетрабутиламмония фосфат, цетилтриметиламмония бромид и др.). В ион-парном режиме селективность разделения неионогенных компонентов будет лимитироваться обращено-фазовым механизмом удерживания, а удерживание оснований и кислот заметно возрастает, при этом улучшается форма хроматографических пиков.

Удерживание в ион-парном режиме обусловлено достаточно сложными равновесными процессами, конкурирующими между собой. С одной стороны, за счет гидрофобных взаимодействий и эффекта вытеснения полярной среды подвижной фазы возможна сорбция гидрофобный ионов на поверхности алкилсиликагеля таким образом, что заряженные группы обращены к подвижной фазе. В этом случае поверхность приобретает ионообменные свойства, и удерживание подчиняется закономерностям ионообменной хроматографии. С другой стороны, возможно образование ионной пары непосредственно в объеме элюента, с последующей ее сорбцией на сорбенте по обращено-фазовому механизму.

Хроматография гидрофильного взаимодействия ( HILIC хроматография)

Хроматография гидрофильного взаимодействия используется для разделения полярных соединений, слабо удерживаемых в обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии. В качестве подвижной фазы в этом варианте хроматографии используются водно-ацетонитрильные смеси с добавлением солей, кислот или оснований. Неподвижными фазами, как правило, являются силикагели, модифицированные полярными группами (амино-, диольные, цианопропильные группы и т.д.). Более полярные соединения удерживаются сильнее. Элюирующая способность подвижной фазы возрастает с увеличением полярности.

Ионообменная и ионная высокоэффективная жидкостная хроматография

Ионообменная хроматография используется для анализа как органических (гетероциклические основания, аминокислоты, белки и др.), так и неорганических (различные катионы и анионы) соединений. Разделение компонентов анализируемой смеси в ионообменной хроматографии основано на обратимом взаимодействии ионов анализируемых веществ с ионообменными группами сорбента. Эти сорбенты представляют собой, в основном, либо полимерные ионообменные смолы (обычно сополимеры стирола и дивинилбензола с привитыми ионообменными группами), либо силикагели с привитыми ионообменными группами. Сорбенты с группами: -NH 3 + , -R 3 N + , -R 2 HN + , -RH 2 N + и др. используются для разделения анионов (аниониты), а сорбенты с группами: -SО 3 – , -RSО 3 – , –СООН, -PО 3 – и др. для разделения катионов (катиониты).

В качестве подвижной фазы в ионообменной хроматографии применяют водные растворы кислот, оснований и солей. Обычно используют буферные растворы, позволяющие поддерживать определенные значения рН. Возможно также использование небольших добавок смешивающихся с водой органических растворителей – ацетонитрила, метанола, этанола, тетрагидрофурана.

Ионная хроматография – вариант ионообменной хроматографии, в котором для детектирования определяемых соединений (ионов) используется кондуктометрический детектор. Для высокочувствительного определения изменений электропроводности проходящей через детектор подвижной фазы фоновая электропроводность подвижной фазы должна быть низкой.

Существуют два основных варианта ионной хроматографии.

Первый из них — двухколоночная ионная хроматография, основан на подавлении электропроводности электролита подвижной фазы с помощью второй ионообменной колонки или специальной мембранной системы подавления, находящейся между аналитической колонкой и детектором. При прохождении через систему электропроводность подвижной фазы снижается.

Второй вариант ионной хроматографии – одноколоночная ионная хроматография. В этом варианте используется подвижная фаза с очень низкой электропроводностью. В качестве электролитов широко применяют слабые органические кислоты: бензойную, салициловую или изофталевую.

Эксклюзионная высокоэффективная жидкостная хроматография

Эксклюзионная хроматография (гель-хроматография) – особый вариант высокоэффективной жидкостной хроматографии, основанный на разделении молекул по их размерам. Распределение молекул между неподвижной и подвижной фазами основано на размерах молекул и частично на их форме и полярности.

Возможны два предельных типа взаимодействия молекул с пористой неподвижной фазой. Молекулы с размерами, превышающими максимальный диаметр пор, вообще не удерживаются и элюируются первыми, перемещаясь одновременно с подвижной фазой. Молекулы с размерами, меньшими чем минимальный диаметр пор сорбента, свободно проникают в поры и элюируются из колонки последними. Остальные молекулы, имеющие промежуточные размеры, удерживаются в порах частично и в ходе элюирования разделяются на фракции в соответствии со своими размерами и, частично, формой проникают в поры сорбента в зависимости от размера и частично в зависимости от своей формы. В результате вещества элюируются с различными временами удерживания.

Ионоэксклюзионная хроматография

В основе механима ионоэксклюзионной хроматографии лежит эффект, в результате которого соединения в ионизированной форме не удерживаются на сорбенте-ионообменнике, тогда как соединения в молекулярной форме распределяются между неподвижной и водной фазами внутри пор ионообменного сорбента и подвижной фазой мигрирующее в пространстве между частицами сорбента. Разделение основано на электростатическом отталкивании, полярных и гидрофобных взаимодействиях между растворенными соединениями и сорбентом.

Анионогенные группы на поверхности сорбента действуют как полупроницаемая «мембрана» между стационарной и подвижной фазами. Отрицательно заряженные компоненты не достигают стационарной подвижной фазы, так как отталкиваются одноименно заряженными функциональными группами и элюируются в «мертвом» (свободном) объеме колонки. Компоненты в молекулярном виде не «отторгаются» катионообменным сорбентом и распределяются между стационарной и подвижной фазами. Различие в степени удерживания неионных компонентов смеси продиктовано совокупностью полярных взаимодействий неионных компонентов с функциональными группами катионообменного сорбента и гидрофобных взаимодействий неионных компонентов с неполярной матрицей сорбента.

Хиральная хроматография

Целью хиральной хроматографии является разделение оптических изомеров. Разделение осуществляется на хиральных неподвижных фазах или на обычных ахиральных неподвижных фазах с использованием хиральных подвижных фаз. В качестве хиральных неподвижных фаз используются сорбенты с поверхностью модифицированной, группами или веществами, имеющими хиральные центры (хитозаны, циклодекстрины, полисахариды, белки и др. (хиральные селекторы). В качестве подвижных фаз в этом случае могут использоваться те же фазы, что и в нормально-фазовой или обращенно-фазовой хроматографии. При использовании ахиральных неподвижных фаз для обеспечения разделения энантиомеров в подвижные фазы добавлятся хиральные модификаторы: хиральные комплексы металлов, нейтральные хиральные лиганды, хиральные ион-парные реагенты и др.

Ультраэффективная жидкостная хроматография

Ультраэффективная жидкостная хроматография представляет собой вариант жидкостной хроматографии, отличающийся большей эффективностью по сравнению с классической высокоэффективной жидкостной хроматографией.

Особенностью ультраэффективной жидкостной хроматографии является использование сорбентов с размером частиц от 1,5 до 2 мкм. Размеры хроматографических колонок обычно составляют от 50 до 150 мм в длину и от 1 до 4 мм в диаметре. Объем вводимой пробы может составлять от 1 до 50 мкл. Использование таких хроматографических колонок позволяет значительно уменьшить время анализа и повысить эффективность хроматографического разделения. Однако, при этом давление на колонке может достигать 80 – 120 МПа, требуемая частота сбора данных детектора может возрастать до 40-100 герц, внеколоночный объем хроматографической системы должен быть минимизирован. Хроматографическое оборудование и колонки, используемые в ультраэффективной жидкостной хроматографии специально адаптированы для выполнения требований этого вида хроматографии.

Оборудование, предназначенное для ультраэффективной жидкостной хроматографии, может использоваться и в классическом варианте высокоэффективной жидкостной хроматографии.

(преимущественно межмолекулярных) на границе раздела фаз. Как способ анализа, ВЭЖХ входит в состав группы методов, которая, ввиду сложности исследуемых объектов, включает предварительное разделение исходной сложной смеси на относительно простые. Полученные простые смеси анализируются затем обычными физико-химическими методами или специальными методами, созданными для хроматографии .

Метод ВЭЖХ находит широкое применение в таких областях, как химия , нефтехимия , биология , биотехнология , медицина , пищевая промышленность , охрана окружающей среды , производство лекарственных препаратов и во многих других.

По механизму разделения анализируемых или разделяемых веществ ВЭЖХ делится на адсорбционную , распределительную , ионообменную , эксклюзионную , лигандообменную и другие.

Следует иметь в виду, что в практической работе разделение часто протекает не по одному, а по нескольким механизмам одновременно. Так, эксклюзионное разделение бывает осложнено адсорбционными эффектами, адсорбционное - распределительными, и наоборот. При этом чем больше различие веществ в пробе по степени ионизации , основности или кислотности , по молекулярной массе, поляризуемости и другим параметрам, тем больше вероятность проявления другого механизма разделения для таких веществ.

Нормально-фазовая ВЭЖХ

Неподвижная фаза более полярна, чем подвижная, поэтому в составе элюента преобладает неполярный растворитель:

• Гексан:изопропанол = 95:5 (для малополярных веществ)
• Хлороформ:метанол = 95:5 (для среднеполярных веществ)
• Хлороформ:метанол = 80:20 (для сильнополярных веществ)

Обращённо-фазовая ВЭЖХ

Неподвижная фаза менее полярна, чем подвижная, поэтому в составе элюента почти всегда присутствует вода. В этом случае всегда можно обеспечить полное растворение БАС в подвижной фазе, почти всегда возможно использовать УФ-детектирование, почти все подвижные фазы взаимно смешиваются, можно использовать градиентное элюирование, можно быстро переуравновесить колонку, колонку можно регенерировать.

Обычными элюентами для обращенно-фазовой ВЭЖХ являются:

• Ацетонитрил:вода
• Метанол:вода
• Изопропанол:вода

Матрицы для ВЭЖХ

В качестве матриц в ВЭЖХ используются неорганические соединения, такие как оксид кремния (силикагель) или оксид алюминия , либо органические полимеры, такие как полистирол (сшитый дивинилбензолом) или полиметакрилат. Силикагель, конечно, в настоящее время общепризнан.

Основные характеристики матрицы:

• Размер частиц (мкм);
• Размер внутренних пор (Å, нм).

Получение силикагеля для ВЭЖХ:

1. Формование микросфер поликремневой кислоты;
2. Сушка частиц силикагеля;
3. Воздушное сепарирование.

Частицы сорбента:

• Регулярные (сферические): выше устойчивость к давлению, выше стоимость;
• Несферические: ниже устойчивость к давлению.

Размер пор в ВЭЖХ - один из наиболее важных параметров. Чем меньше размер пор, тем хуже их проницаемость для молекул элюируемых веществ. А следовательно, тем хуже сорбционная емкость сорбентов. Чем крупнее поры, тем, во-первых, меньше механическая устойчивость частиц сорбента, а, во-вторых, тем меньше сорбционная поверхность, следовательно, хуже эффективность.

Прививки неподвижной фазы

Нормально-фазовая ВЭЖХ:

• Неподвижная фаза с пропилнитрильной прививкой (нитрильной);
• Неподвижная фаза с пропиламинной прививкой (аминной).

Обращенно-фазовая ВЭЖХ:

• Неподвижная фаза с алкильной прививкой;
• Неподвижная фаза с алкилсилильной прививкой.

Энд-кэппирование - защита непривитых участков сорбента дополнительной прививкой «маленькими» молекулами. Гидрофобный энд-кэппинг (С1, С2): выше селективность, хуже смачиваемость; гидрофильный энд-кэппинг (диол): ниже селективность, выше смачиваемость.

Детекторы для ВЭЖХ

• Ультрафиолетовый
• Диодно-матричный
• Флуоресцентный
• Электрохимический
• Рефрактометрический
• Масс-селективный

Ссылки

Wikimedia Foundation . 2010 .

Смотреть что такое "Высокоэффективная жидкостная хроматография" в других словарях:

высокоэффективная жидкостная хроматография - — [А.С.Гольдберг. Англо русский энергетический словарь. 2006 г.] Тематики энергетика в целом EN high performance liquid chromatographyHPLC … Справочник технического переводчика

Термин высокоэффективная жидкостная хроматография Термин на английском high performance liquid chromatography Синонимы Аббревиатуры ВЭЖХ, HPLC Связанные термины адсорбция, олигопептид, протеомика, сорбент, фуллерен, эндоэдральный, хроматография… …

Жидкостная хроматография, в к рой для повышения эффективности разделения р ритель (элюент) под давлением (более 3х107 Па) прокачивают через колонки, заполненные сорбентом с частицами малого диаметра (до 1 мкм), а также используют перфузионные… …

Вид хрома тографии, в к рой подвижной фазой служитжидкость (элюент), а неподвижной та. сорбент, тв. носитель с нанесённой на его поверхность жидкостью или гель. Осуществляют в колонке, заполненной сорбентом (колоночная хроматография), на плоской… … Естествознание. Энциклопедический словарь

- [κρώμα (υрома) цвет] процесс, основанный на неодинаковой способности отдельных компонентов смеси (жидкой или газообразной) удерживаться на поверхности адсорбента как при поглощении их из потока носителя, так и при… … Геологическая энциклопедия

- (от др. греч … Википедия

Термин хроматография Термин на английском chromatography Синонимы Аббревиатуры Связанные термины высокоэффективная жидкостная хроматография, клатрат, лаборатория на чипе, порометрия, протеом, протеомика, сорбент, фермент, фуллерен, эндоэдральный… … Энциклопедический словарь нанотехнологий

Жидкостная хроматография, основанная на разл. способности разделяемых ионов к ионному обмену с фиксир. ионами сорбента, образующимися в результате диссоциации ионогенных групп последнего. Для разделения катионов используют катиониты, для… … Химическая энциклопедия

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография … Словарь сокращений русского языка

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) один из эффективных методов разделения сложных смесей веществ, широко применяемый как в аналитической химии, так и в химической технологии. Основой хроматографического разделения является участие … Википедия

Книги

• Практическая высокоэффективная жидкостная хроматография , Вероника Р. Майер. Представляем читателю 5-е издание книги, которое расширено за счет современных методов и оборудования. В книге многое доработано и добавлено большое количество ссылок. Те места в тексте, где…

Жидкостная хроматография это метод разделения и анализа сложных смесей веществ, в котором подвижной фазой служит жидкость. Он применим для разделения более широкого круга веществ, чем метод газовой хроматографии. Это связано с тем, что большинство веществ не обладает летучестью, многие из них неустойчивы при высоких температурах (особенно высокомолекулярные соединения) и разлагаются при переводе в газообразное состояние. Разделение веществ жидкостной хроматографией чаще всего производится при комнатной температуре.

Особенности всех видов жидкостной хроматографии обусловлены тем, что подвижной фазой в ней является жидкость, а сорбция компонентов из газообразного и жидкого элюента протекает по-разному. Если в газовой хроматографии газ-носитель выполняет только транспортную функцию и неподвижной фазой не сорбируется, то жидкая подвижная фаза в жидкостной хроматографии является активным элюентом, его молекулы могут сорбироваться неподвижной фазой. При прохождении через колонку молекулы компонентов анализируемой смеси, находящиеся в элюенте, должны вытеснить молекулы элюента из поверхностного слоя сорбента, что приводит к уменьшению энергии взаимодействия молекул анализируемого вещества с поверхностью сорбента. Поэтому величины удерживаемых объемов V R , пропорциональные изменению свободной энергии системы, в жидкостной хроматографии меньше, чем в газовой, а диапазон линейности изотермы сорбции в жидкостной хроматографии шире.

Применяя различные элюенты, можно изменять параметры удерживания и селективность хроматографической системы. Селективность в жидкостной хроматографии в отличие от газовой определяется не одним, а двумя факторами природой подвижной (элюент) и неподвижной фаз.

Жидкая подвижная фаза имеет большую плотность и вязкость, чем газообразная, коэффициенты диффузии D ж на 34 порядка ниже, чем в газе. Это приводит к замедлению массообмена в жидкостной хроматографии по сравнению с газовой. Уравнение Ван-Деемтера в связи с тем, что членВ в жидкостной хроматографии роли не играет (D ж D г ), видоизменяется и графическая зависимость эффективностиН от линейной скорости потока подвижной фазы имеет вид, представленный на рис. 1.9.

В классическом варианте колоночной жидкостной хроматографии в стеклянную колонку высотой 1–2 м, заполненную сорбентом с размером частиц 100 мкм и элюентом, вводят анализируемую пробу, растворенную в элюенте, и пропускают элюент, отбирая на выходе из колонки порции элюата. Этот вариант жидкостной хроматографии до настоящего времени применяют в лабораторной практике, но так как скорость прохождения элюента под действием силы тяжести мала, анализ продолжителен.

Современный вариант жидкостной хроматографии так называемая высокоэффективная жидкостная хроматография ВЭЖХиспользует объемно- и поверхностно-пористые сорбенты с размером частиц 5–10 мкм, нагнетательные насосы, обеспечивающие давление в системе до 400 атм., высокочувствительные детекторы. Быстрый массоперенос и высокая эффективность разделения позволяют использовать ВЭЖХ для разделения молекул (жидкостно-адсорбционная и жидкость-жидкостная распределительная хроматографии), для разделения ионов (ионообменная, ионная, ион-парная хроматография), для разделения макромолекул (эксклюзионная хроматографии).

1.3. УДЕРЖИВАНИЕ И СИЛА РАСТВОРИТЕЛЯ

Для того чтобы анализируемые вещества разделялись на колонке, как уже упоминалось выше, коэффициент емкости k" должен быть больше 0, т.е. вещества должны удерживаться неподвижной фазой, сорбентом. Однако коэффициент емкости недолжен быть и слишком большим, чтобы получить приемлемое время элюирования. Если для данной смеси веществ выбрана неподвижная фаза, которая их удерживает, то дальнейшая работа по разработке методики анализа заключается в выборе такого растворителя, который обеспечил бы в идеальном случае различные для всех компонентов, но приемлемо не очень большие k". Этого добиваются, меняя элюирующую силу растворителя.

В случае адсорбционной хроматографии на силикагеле или оксиде алюминия, как правило, силу двухкомпонентного растворителя (например, гексана с добавкой изопропанола) увеличивают, увеличивая в нем содержание полярного компонента (изопропанола), или же уменьшают, уменьшая содержание изопропанола. Если содержание полярного компонента становится слишком малым (менее 0,1%), следует заменить его более слабым по элюирующей силе. Так же поступают, заменяя на другие либо полярную, либо неполярную составляющую и в том случае, если данная система не обеспечивает желаемой селективности по отношению к интересующим компонентам смеси. При подборе систем растворителей принимают во внимание как растворимости компонентов смеси, так и элюотропные ряды растворителей, составленные разными авторами.

Примерно так же подбирают силу растворителя в случае использования привитых полярных фаз (нитрил, амино, диол, нитро и др.), учитывая возможные химические реакции и исключая опасные для фазы растворители (например, альдегиды и кетоны для аминофазы).

В случае обращенно-фазной хроматографии силу растворителя увеличивают, повышая содержание в элюенте органической составляющей (метанола, ацетонитрила или ТГФ) и уменьшают, добавляя больше воды. Если не удается добиться желаемой селективности, используют другую органическую составляющую либо пытаются изменить ее с помощью разных добавок (кислот, ион-парных реагентов и др.).

При разделениях методом ионообменной хроматографии силу растворителя меняют, увеличивая или уменьшая концентрацию буферного раствора или меняя рН, в некоторых случаях используют модификацию органическими веществами.

Однако, особенно в случае сложных природных и биологических смесей, зачастую не удается подобрать силу растворителя таким образом, чтобы все компоненты пробы элюировались за приемлемый срок. Тогда приходится прибегать к градиентному элюированию, т.е. использовать растворитель, элюирующая сила которого в процессе анализа изменяется так, что она постоянно увеличивается по заранее заданной программе. Таким приемом удается добиться элюирования всех компонентов сложных смесей за относительно короткий промежуток времени и их разделения на компоненты в виде узких пиков.

1.6.1. Адсорбционная жидкостная хроматография . Адсорбционная жидкостная хроматография в зависимости от полярности неподвижной и подвижной фаз подразделяется на нормально-фазовую (НФХ) и обращенно-фазовую (ОФХ) хроматографии. В НФХ используют полярный адсорбент и неполярные подвижные фазы, в ОФХнеполярный адсорбент и полярные подвижные фазы, но в обоих вариантах выбор подвижной фазы часто важнее, чем выбор неподвижной. Неподвижная фаза должна удерживать разделяемые вещества. Подвижная фаза, т. е. растворитель, должна обеспечивать различную емкость колонки и эффективное разделение за приемлемое время.

В качестве неподвижной фазы в адсорбционной жидкостной хроматографии применяют полярные и неполярные тонкодисперсные пористые материалы с удельной поверхностью более 50 м 2 /г. Полярные адсорбенты (SiO 2 ,Al 2 O 3 , флорисил и др.) имеют на поверхности слабокислотные группы, способные удерживать вещества с основными свойствами. Эти адсорбенты используют главным образом для разделения неполярных и среднеполярных соединений. Их недостатоквысокая чувствительность к содержанию воды в применяемых элюентах. Для устранения этого недостатка полярные сорбенты обрабатывают аминами, диолами и другими реагентами, в результате чего происходит поверхностная прививка этих реагентов, модифицирование поверхности и изменение селективности по отношению к анализируемым веществам.

Неполярные адсорбенты (графитированные сажи, диатомит, кизельгур) неселективны к полярным молекулам. Для получения неполярных адсорбентов часто на поверхность, например, силикагеля прививают неполярные группы, например, алкилсилильные SiR 3 , гдеRалкильные группы С 2 С 22 .

Подвижная фаза должна полностью растворять анализируемую пробу, обладать невысокой вязкостью (чтобы коэффициенты диффузии были достаточно большими), желательно, чтобы из нее было возможно выделить разделенные компоненты. Она должна быть инертной по отношению к материалам всех частей хроматографа, безопасной, дешевой, подходящей для детектора.

Подвижные фазы, применяемые в жидкостной хроматографии, различаются по своей элюирующей силе. Элюирующая сила растворителя показывает, во сколько раз энергия сорбции данного элюента на данном адсорбенте больше, чем энергия сорбции элюента, выбранного в качестве стандарта, например н-гептана. Слабые растворители плохо адсорбируются неподвижной фазой, поэтому коэффициенты распределения сорбируемых веществ (сорбата) высокие. Наоборот, сильные растворители адсорбируются хорошо, поэтому коэффициенты распределения сорбата низкие. Растворитель тем сильнее, чем выше растворимость в нем анализируемой пробы, чем сильнее взаимодействие растворитель – сорбат.

Для обеспечения высокой эффективности разделения на колонке необходимо подобрать такую подвижную фазу, которая имеет полярность, оптимальную для разделяемой смеси в выбранных условиях разделения. Обычно сначала выбирают неподвижную фазу, которая имеет полярность, близкую к полярности разделяемых компонентов. Затем подбирают подвижную фазу, добиваясь того, чтобы коэффициент емкости k " оказался в интервале от 2 до 5. Если полярность подвижной фазы слишком близка к полярности неподвижной, время удерживания компонентов будет слишком малым, а если полярности подвижной и неподвижной фаз различаются очень сильно, время удерживания становится слишком большим.

При подборе подвижных фаз ориентируются на так называемые элюотропные ряды, основанные на применении индексов полярности Снайдера Р" , который подразделяет все растворители на сильные (полярные) и слабые (слабополярные и неполярные). В основе шкалы полярности лежит растворимость веществ, используемых в качестве подвижных фаз, в диоксане, нитрометане и этаноле.

В таблице 1.2 приведены значения индексов полярности и элюирующей силы (по отношению к SiO 2) ряда растворителей, наиболее часто применяемых в жидкостной хроматографии в качестве подвижных фаз. Здесь же указаны коротковолновые границы прозрачности этих растворителей, что облегчает подбор условий детектирования компонентов смеси.

Таблица 1.2

Характеристики растворителей, используемых в жидкостной хроматографии

Растворитель	Индекс полярности	Элюирующая сила (SiO 2)	Коротковолновая граница прозрачности
Фторалкан
Циклогексан
н -Гексан
Тетрахлорметан
Диизопропиловый эфир
Диэтиловый эфир
Дихлорметан
Тетрагидрофуран
Хлороформ
Уксусная кислота
Ацетонитрил
Нитрометан

В жидкостной хроматографии часто используют не индивидуальные растворители, а их смеси. Часто незначительные добавки другого растворителя, особенно воды, существенно увеличивают элюирующую силу элюента.

При разделении многокомпонентных смесей одна подвижная фаза в качестве элюента может не разделить все компоненты пробы за приемлемое время. В этом случае применяют метод ступенчатого, или градиентного, элюирования, при котором в процессе хроматографирования последовательно используют все более сильные элюенты, что позволяет элюировать сильноудерживаемые вещества за меньшее время.

В жидкостной хроматографии существуют некоторые эмпирические правила, которые очень полезны при выборе элюента:

 сорбция соединения, как правило, увеличивается с ростом в нем количества двойных связей и ОН-групп;

 сорбция уменьшается в ряду органических соединений: кислоты спиртыальдегидыкетонысложные эфирыненасыщенные углеводородынасыщенные углеводороды;

 для разделения веществ разной полярности и разделения веществ разных классов применяют нормально-фазовую хроматографию: анализируемая проба растворяется и элюируется неполярным элюентом, соединения разных классов выходят из колонки с полярным адсорбентом за разное время, при этом время удерживания соединений с разными функциональными группами увеличивается при переходе от неполярных соединений к слабополярным. Для очень полярных молекул значения времени удерживания так велики, что при использовании неполярного элюента анализ невозможен. Для уменьшения времени удерживания полярных компонентов переходят к полярным элюентам;

 в обращенно-фазовом варианте неподвижная фаза (неполярный адсорбент) сильнее адсорбирует неполярный компонент из полярных элюентов, например из воды;

 снижая полярность элюента добавлением менее полярного растворителя, можно уменьшить удерживание компонентов.

1.6.2. Распределительная жидкостная хроматография. В распределительной или жидкость-жидкостной хроматографии разделение компонентов анализируемой пробы обусловлено различиями в коэффициентах их распределения между двумя не смешивающимися между собой жидкими фазами, одна из которых неподвижная и находится на поверхности или в порах твердого неподвижного носителя, а втораяподвижная.

По характеру сил взаимодействия, обусловливающих различное распределение между двумя фазами веществ, отличающихся своим химическим строением, распределительная хроматография подобна адсорбционной, т. е. и здесь разделение основано на различии в силах межмолекулярного взаимодействия компонентов анализируемой пробы с неподвижной и подвижной жидкими фазами.

В зависимости от техники выполнения распределительная хроматография, как и адсорбционная, может быть колоночной или плоскостной (бумажной или тонкослойной).

В качестве твердых носителей используют вещества, индифферентные по отношению к подвижному растворителю и компонентам анализируемой пробы, но способные удерживать на поверхности и в порах неподвижную фазу. Чаще всего в качестве носителей применяют полярные вещества (целлюлозу, силикагель, крахмал). На них наносят неподвижную фазу полярный растворитель, чаще всего воду или спирт. В качестве подвижных фаз в этом случае используют менее полярные или неполярные вещества (спирты, амины, кетоны, углеводороды и др.). Такой вариант распределительной хроматографии называетсянормально-фазовым . Он применяется для разделения полярных веществ.

Второй вариант распределительной хроматографии отличается тем, что в качестве неподвижной твердой фазы используют неполярные носители (резину, фторопласт, гидрофобизированный силикагель), в качестве неподвижной жидкой фазы неполярные растворители (углеводороды), а в качестве подвижной жидкой фазыполярные растворители (спирты, альдегиды, кетоны и др., часто вода). Этот вариант распределительной хроматографии называетсяобращенно-фазовой и используется для разделения неполярных веществ.

Для достижения оптимального разделения компонентов анализируемой пробы очень важное значение имеет подбор подвижной фазы. Растворители (подвижные и неподвижные жидкие фазы) должны подбираться так, чтобы коэффициенты распределения компонентов смеси различались достаточно существенно. К жидким фазам предъявляются следующие требования :

1) используемые растворители должны хорошо растворять разделяемые вещества, причем их растворимость в неподвижной фазе должна быть больше, чем в подвижной;

2) растворители, используемые в качестве подвижной и неподвижной фаз, должны быть взаимонасыщаемы, т. е. состав растворителя должен быть постоянным во время прохождения через колонку;

3) взаимодействие растворителей, используемых в качестве подвижной фазы, с неподвижной фазой должно быть минимальным.

Чаще всего в распределительной жидкостной хроматографии в качестве подвижных жидких фаз применяют не индивидуальные вещества, а их смеси в различных соотношениях. Это позволяет регулировать полярность подвижной фазы, изменять соотношение полярностей подвижной и неподвижной фаз и добиваться оптимальных условий разделения компонентов конкретной анализируемой смеси.

Существенным недостатком этого хроматографического метода является достаточно быстрое смывание нанесённой неподвижной жидкой фазы с носителя. Для его устранения растворитель, используемый в качестве подвижной фазы, насыщают веществом, применяемым в качестве неподвижной жидкой фазы, или стабилизируют неподвижную жидкую фазу прививкой ее к носителю.

Разновидностью распределительной жидкостной хроматографии является широко используемый метод ВЭЖХ.

Самыми распространенными хроматографическими системами являются системы, имеющие модульный принцип сборки. Насосы, дегазирующие устройства, детекторы, дозаторы (автосамплеры), термостаты для колонок, коллекторы фракций, блоки управления хроматографической системой и регистрирующие устройства выпускаются в виде отдельных модулей. Широкий выбор модулей позволяет гибко решать различные аналитические задачи, быстро менять при необходимости конфигурацию системы с минимальными расходами. Вместе с тем выпускаются и мономодульные (интегрированные) ЖХ, главным преимуществом которых является миниатюризация отдельных блоков, компактность прибора.

В зависимости от способа элюирования жидкостные хроматографы делятся на изократические и градиентные.

Схема изократического хроматографа

Подвижная фазаиз емкости (1) через входной фильтр (9) подается прецизионным насосом высокого давления (2) в систему ввода образца (3) - ручной инжектор или автосамплер, туда же вводитсяпроба. Далее, через in-line фильтр (8), образец с током подвижной фазы поступает в элемент (элементы) разделения (4) - через предколонку в разделительную колонку. Затем, элюат поступает вдетектор (5) и удаляется в сливную емкость (7). При протекании элюата через измерительный контур детектора происходит регистрация хроматограммы и передача данных на аналоговый регистратор (самописец) (6) или иную систему сбора и обработки хроматографических данных (интегратор или компьютер). В зависимости от конструкции функциональных модулей управление системой может осуществляться с клавиатуры управляющего модуля (как правило насоса или системного контролера), с клавиатур каждого из модулей системы или производиться управляющей программой с персонального компьютера.

В случае градиентного элюирования используются два принципиально различных типа жидкостных хроматографов. Они отличаются точкой формирования градиента состава подвижной фазы.

Схема градиентного хроматографа с формированием градиента состава подвижной фазы на линии низкого давления.

Подвижная фаза из емкостей (1) через входные фильтры (9) и программатор градиента (10) подается прецизионным насосом высокого давления (2) в систему ввода образца (3) - ручной инжектор или автосамплер, туда же вводится проба. Работой клапанов программатора градиента управляет либо управляющий модуль системы (насос или контроллер), либо управляющая программа ПК. Системы такого типа формируют бинарный, трехмерный и четырехмерный градиент. Форма функции отработки градиента зависит от конкретного управляющего модуля или программы управления, а также функциональных возможностей управляемых и управляющих модулей. Далее, через in-line фильтр (8), образец с током подвижной фазы поступает в элемент (элементы) разделения (4) - через предколонку в разделительную колонку. Затем, элюат поступает в детектор (5) и удаляется в сливную емкость (7). При протекании элюата через измерительный контур детектора происходит регистрация хроматограммы и передача данных на аналоговый регистратор (самописец) (6) или иную систему сбора и обработки хроматографических данных (интегратор или компьютер). В зависимости от конструкции функциональных модулей управление системой может осуществляться с клавиатуры управляющего модуля (как правило, насоса или системного контролера), или производиться управляющей программой с персонального компьютера. В случае управления управляющим модулем возможно независимое управление детектором с его собственной клавиатуры.

Несмотря на кажущуюся привлекательность таких систем (в них используется всего лишь один прецизионный насос высокого давления), данные системы обладают рядом недостатков, среди которых основным, пожалуй, является жесткая необходимость тщательной дегазации компонентов подвижной фазы еще до смесителя низкого давления (камеры программатора градиента). Она осуществляется с помощью специальных проточных дегазаторов. Из-за этого факта стоимость их становится сравнимой с другим типом градиентных систем - систем с формированием состава градиента подвижной фазы на линии высокого давления.

Принципиальным отличием систем с формированием состава градиента подвижной фазы на линии высокого давления является смешение компонентов в линии высокого давления, естественно, что при данном подходе количество прецизионных насосов определяется количеством резервуаров для смешивания подвижной фазы. При таком подходе требования к тщательности дегазации компонентов существенно снижаются.

Схема градиентного хроматографа с формированием градиента состава подвижной фазы на линии высокого давления.

Подвижная фаза из емкостей (1) через входные фильтры (9) подается прецизионными насосами высокого давления (2 и 11) через статический или динамический смеситель потока (10) в систему ввода образца (3) - ручной инжектор или автосамплер, туда же вводится проба. Работой управляемых насосов управляет либо управляющий модуль системы (насос “master pump” или контроллер), либо управляющая программа ПК. В этом случае все насосы являются управляемыми. Системы такого типа формируют бинарный или трехмерный градиент. Форма функции отработки градиента зависит от конкретного управляющего модуля или программы управления, а также функциональных возможностей управляемых и управляющих модулей. Далее, через in-line фильтр(8), образец с током подвижной фазы поступает в элемент (элементы) разделения (4) - через предколонку в разделительную колонку. Затем элюат поступает в детектор (5) и удаляется в сливную емкость (7). При протекании элюата через измерительный контур детектора происходит регистрация хроматограммы и передача данных на аналоговый регистратор (самописец) (6) или иную систему сбора и обработки хроматографических данных (интегратор или компьютер). В зависимости от конструкции функциональных модулей управление системой может осуществляться с клавиатуры управляющего модуля (как правило, насоса или системного контролера), или производиться управляющей программой с персонального компьютера. В случае управления управляющим модулем возможно независимое управление детектором с его собственной клавиатуры.

Предложенные схемы являются достаточно упрощенными. В состав систем могут быть включены дополнительные устройства - термостат колонок, системы постколоночной дериватизации, системы пробоподготовки и концентрирования образца, рециклер растворителя, мембранные системы подавления фоновой электропроводности (для ионной хроматографии), дополнительные защитные системы (фильтры, колонки) и т.д. На схемах, также отдельно не показаны манометрические модули. Как правило, эти устройства встраиваются в насосные блоки. Эти блоки могут объединять в себе несколько насосов, насос с программатором градиента, а также общий системный контроллер. Структура системы зависит от ее комплектации и каждого конкретного производителя.

Такое радикальное усложнение технического сопровождения хроматографического процесса приводит к возникновению ряда требований к свойствам подвижной фазы, отсутствующих в классической колоночной и планарной хроматографии. Жидкая фазадолжна быть пригодна для детектирования (быть прозрачной в заданной области спектра или иметь низкий показатель преломления, определенную электропроводность или диэлектрическую проницаемость и т.д.), инертна к материалам деталей хроматографического тракта, не образовывать газовых пузырей в клапанах насоса и ячейке детектора, не иметь механических примесей.

В жидкостной хроматографии используют множество типов насосов. ПриЖХнизкого давления зачастую используют перистальтические насосы (Рис.1).

Рис.1 Програмируемый перистальтический насос MasterFlex.

При ВЭЖХдля обеспечения расхода подвижной фазы через колонку с указанными параметрами используются насосы высокого давления.

К наиболее важным техническим характеристикам насосов для ВЭЖХотносятся: диапа­зон расхода; максимальное рабочее давление; воспроизводимость расхода; диапазон пульса­ций подачи растворителя.

По характеру подачи растворителя насосы могут быть постоянной подачи (расхода) и постоянного давления. В основном при аналитической работе используется режим постоян­ного расхода, при заполнении колонок - постоянного давления.

По принципу действия насосы для ВЭЖХ делятся на шприцевые и наплунжерные возвратно-поступательные .

Шприцевые насосы

Основной отличительной особенностью данных насосов является цикличность их работы, в связи с чем хроматографы, в которых применяются данные насосы, также отличаются цикличностью работы.

Рис. 2. Принципиальное устройство шприцевого насоса дляВЭЖХ.

Рис. 2А. Шприцевой насос.

Блок управления БУ подает напряжение на двигатель Д, определяющее скорость и направление его вращения. Вращение двигателя с помощью редуктора Р преобразуется в пе­ремещение поршня П внутри цилиндра Д. Работа насоса осуществляется в 2 цикла. В цикл заполнения клапан К2 закрыт, К1 - открыт, растворитель поступает из резервуара в цилиндр Ц. В режиме подачи клапан К1 закрыт, а через клапан К2 подвижная фазапоступает в дози­рующее устройство.

Для насосов этого типа характерно практически полное отсутствие пульсаций потока подвижной фазы в ходе работы.

Недостатки насоса:

а) большой расход времени и растворителя на промывку при смене растворителя;

б) ограниченный объемом шприца объем ПФ, а следовательно ограниченное время разделения;

в) приостановка разделения во время заполнения насоса;

г) большие габариты и вес при обеспечении большого расхода и давления (нужен мощный двигатель и большое усилие поршня с его большой площадью).

Плунжерные возвратно-поступательные насосы.

Рис. 3. Принципиальное устройство плунжерного насоса.

Принцип действия.

Двигатель Д через редуктор Р приводит в возвратно-поступательное движение плун­жер П, перемещающийся в рабочей головке насоса. Клапаны К1 и К2 открываются, когда на­сос находится в фазе всасывания и подачи соответственно. Величина объемной подачи опре­деляется тремя параметрами: диаметром плунжера (обычно 3.13; 5.0; 7.0 мм), его амплитудой (12-18 мм)и частотой(что зависит от скорости вращения двигателя и редуктора).

Насосы этого типа обеспечивают постоянную объемную подачу подвижной фазы длительное время. Максимальное рабочее давление 300-500 атм, расход 0.01-10 мл/мин. Воспроизводимость объемной подачи -0.5%. Основной недостаток - растворитель подается в систему в виде серии последовательных импульсов, поэтому существуют пульсации давле­ния и потока (Рис.4). Это является основной причиной повышенного шума и снижения чувствитель­ности почти всех детекторов, применяемых в ЖХ, особенно электрохимического.

Рис.4. Пульсации плунжерного насоса.

Способы борьбы с пульсациями.

1. Применение демпфирующих устройств .

Это спиральные трубки специального профиля из нержавеющей стали, включенные последовательно или параллельно в систему между насосом и дозатором.

Рис. 5. Спиральный демпфер.

Демпферраскручивается при увеличении давления в нем (ускорение хода насоса). При спаде давления он скручивается, его объем уменьшается, он выдавливает из себя часть растворителя, поддерживая постоянным расход и уменьшая пульсации. Такой демпфер хо­рошо работает при давлении 50 атм и выше.

При давления 5-30 атм лучше сглаживает пуль­сации воздушный демпфер , изготовленный из колонки (рис. 6.). Воздух в заглушенной ко­лонке (6х200 мм) сжимается и пульсации гасятся. Воздух в нем растворяется за 24 часа.

Рис. 6. Воздушный демпфер.

2. Применение электронных устройств.

При использовании электронного датчика давления можно использовать показания датчика для управления работой насоса. При спаде давления увеличивается скорость враще­ния двигателя и компенсирует уменьшение давления. Также можно скомпенсировать утечки в клапанах и частично в манжетах. Применение электронного демпфера(БПЖ-80, ХПЖ-1 и т.д.) позволяет снизить пульсации давления до 1 атм при давлении 100-150 кгс/см2.

1.6.3. Ионообменная, ионная, ион-парная хроматография. В основе методов ионообменной, ионной и ион-парной хроматографии лежит динамический процесс замещения ионов, связанных с неподвижной фазой, ионами элюента, поступающими в колонку. Основная цель хроматографического процесса  разделение неорганических или органических ионов одного и того же знака. Удерживание в этих видах хроматографии определяется изменением свободной энергии реакции ионного обмена. Соотношение концентраций обменивающихся ионов в растворе и в фазе сорбента характеризуются ионообменным равновесием. Ионный обмен заключается в том, что некоторые вещества (ионообменники) при погружении в раствор электролита поглощают из него катионы или анионы, выделяя в раствор эквивалентное количество других ионов с зарядом того же знака. Между катионообменником и раствором происходит обмен катионами, между анионообменником и раствором – обмен анионами.

Катионообменники представляют собой чаще всего специально синтезированные нерастворимые полимерные вещества, содержащие в своей структуре ионогенные группы кислотного характера: –SO 3 H; –COOH; –OH; –PO 3 H 2 ; –AsO 3 H 2 .

Химические формулы катионообменников схематически можно изобразить как R-SO 3 H; R-SO 3 Na. В первом случае катионообменник находится в Н-форме, во второмв Na-форме. R – полимерная матрица.

Катионообменные реакции записывают как обычные гетерогенные химические реакции:

RН +Na + RNa+H +

Анионообменники содержат в своей структуре ионогенные группы основного характера: –N(CH 3) 3 + ; =NH 2 + ; =NH + и др. Их химические формулы могут быть изображены как RNH 3 OH и RNH 3 Cl или ROH, RCl. В первом случае анионообменник находится в ОН-форме, во втором – в Сl-форме. Анионообменную реакцию можно записать следующим образом:

R–OH+Cl – RCl+OH –

Известны амфотерные ионообменники, содержащие в своей структуре и кислотные, и основные группы. Ионообменники, имеющие в своем составе однотипные (например, SO 3 H) кислотные (основные) группы, называют монофункциональными; ионообменники, содержащие разнотипные (например,SO 3 H,ОН) кислотные (основные) группыполифункциональными.

Монофункциональные ионообменники получают реакцией полимеризации. Реакция поликонденсации позволяет получать полифункциональные ионообменники. Для того, чтобы полученные ионообменники имели достаточно высокие эксплуатационные характеристики, они должны быть нерастворимыми, но набухающими в соответствующем растворителе и иметь достаточно большое количество ионогенных групп, способных к обмену с ионогенными группами анализируемой пробы. Это может быть достигнуто, если полученные полимерные цепи достаточно разветвлены и связаны друг с другом «сшивающими мостиками». Например, при получении катионообменников полимеризационного типа на основе стирола в качестве сшивающего агента чаще всего используется дивинилбензол, введение которого в количестве до 16% обеспечивает получение ионообменников с различной степенью набухания и, следовательно, позволяет регулировать пористость ионообменника. Степенью набухания ионита, выражаемой в миллилитр/грамм, называют объем упакованного в колонку 1 г воздушно-сухого ионообменника.

Ионообменник поглощает, как правило, один из противоионов ионов, находящихся в подвижной фазе, т. е. проявляет определенную селективность. Экспериментально установлены ряды сродства, или селективности, ионов по отношению к ионообменникам разных типов. Например, при низких концентрациях раствора на сильнокислотных катионообменниках ионы с одинаковым зарядом сорбируются в такой последовательности:

Li +  Na +  K +  Rb +  Cs +

Mg 2+  Ca 2+  Sr 2+  Ba 2+ .

Для ионов с разными зарядами сорбируемость увеличивается с увеличением заряда:

Na + Ca 2+

Однако изменение условий проведения реакции ионного обмена может привести к обращению ряда. Ряды сродства установлены и для анионообменников. Например, сорбируемость анионов на сильноосновных анионитах увеличивается в ряду:

F –  OH –  Cl –  Br –  NO 3 –  J –  SCN –  ClO 4 – .

Ионообменики, содержащие в своей структуре сильнокислотные или сильноосновные группы, вступают в реакции ионного обмена с любыми ионами, находящимися в растворе обладающими зарядами того же знака, что и знак противоиона. Такие ионообменники называют универсальными.

Процесс ионного обмена между анализируемым веществом и ионообменником может быть осуществлен одним из трех способов: статическим, динамическим (способ ионообменного фильтра) и хроматографическим.

Статический метод ионного обмена заключается в том, что навеску ионита приводят в контакт с определенным объемом раствора и перемешивают или встряхивают определенное время до установления равновесия. Это быстрый и простой способ ионного обмена, применяющийся для концентрирования ионов из разбавленных растворов, удаления ненужных примесей, но он не обеспечивает полного поглощения ионов, так как ионный обменэто неравновесный процесс, и вследствие этого не гарантирует полного разделения ионов.

При проведении ионного обмена динамическим способом через колонку с ионитом пропускают раствор, который по мере перемещения по колонке контактирует с новыми гранулами ионита. Этот процесс обеспечивает более полный обмен, чем статический метод, так как продукты обмена удаляются потоком раствора. Им можно концентрировать ионы из разбавленных растворов и разделять ионы, сильно различающиеся по свойствам, например, разнозарядные ионы (отделять катионы от анионов), но разделение ионов одного знака заряда практически невозможно. Количественное разделение таких ионов возможно только при многократном повторении сорбционно-десорбционных элементарных актов в динамических условиях, т. е.хроматографическим методом . При работе этим методом применяют высокие слои ионита и в этот слой вводят разделяемую смесь в количестве, значительно меньшем емкости колонки, благодаря чему и обеспечивается многократное повторение элементарных актов ионного обмена.

По технике проведения анализа ионообменная хроматография сходна с молекулярной и может осуществляться по элюентному (проявительному), фронтальному и вытеснительному вариантам. Отличие между молекулярной и ионообменной хроматографией состоит в том, что в молекулярной хроматографии разделенные компоненты смеси элюируются из колонки чистым элюентом, а в ионообменной в качестве элюента используют раствор электролита. При этом обмениваемый ион элюента должен сорбироваться менее селективно, чем любой из ионов разделяемой смеси.

При проведении проявительной ионообменной хроматографии, которая применяется наиболее часто, колонку, заполненную ионитом, сначала промывают раствором электролита до тех пор, пока в ионите не произойдет полное замещение всех его ионов на ионы, содержащиеся в элюенте. Затем в колонку вводят небольшой объем раствора анализируемого вещества, имеющего в своем составе разделяемые ионы в количестве около 1% от емкости ионита. Далее колонку промывают раствором элюента, отбирая фракции элюата и анализируя их.

Смесь ионов Cl – , Br – , J – можно разделить на высокоосновном анионите (сшитый полистирол, содержащий группы четвертичных аммониевых основанийN (CH 3) 3 +), например, AB-17, имеющем ряд избирательности (селективности): NO 3 – Cl – Br – J – . Вследствие этого в качестве элюента используется раствор NaNO 3 . Вначале через ионит пропускается этот раствор до полного насыщения ионами NO 3 – . При введении в колонку разделяемой смеси ионы Cl – , Br – , J – поглощаются анионитом, вытеснив ионы NO 3 – . При последующем промывании колонки раствором NaNO 3 ионы Cl – , Br – , J – в верхних слоях анионита постепенно вновь замещаются ионами NO 3 – . Быстрее всех будут вытесняться ионы Cl – , дольше всех в колонку задержатся ионы J – . Различие в селективности ионита к ионам смеси приводит к тому, что в колонке образуются отдельные зоны сорбированных ионов Cl – , Br – и J – , перемещающиеся по колонке с различной скоростью. По мере перемещения по колонке расстояние между зонами увеличивается. В каждой зоне находится лишь один из анионов разделяемой смеси и анион элюента, в промежутке между зонами лишь анион элюента. Таким образом, в элюенте на выходе из колонки будут появляться фракции, в которых содержатся отдельные компоненты разделяемой смеси.

Для решения практических задач варьируют условия разделения ионов, подбирая подходящую подвижную фазу (состав, концентрация, рН, ионная сила) или изменяя пористость полимерной матрицы ионита, т. е. число межцепных связей в матрице, и создавая ионитовые сита, проницаемые для одних ионов и способные к их обмену и непроницаемые для других. Можно также изменять природу и взаимное расположение ионогенных групп, а также получать сорбенты, способные к селективным химическим реакциям за счет комплексообразования. Высокой селективностью обладают, например, комплексообразующие ионообменники, содержащие в своей структуре хелатообразующие группы органических реагентов диметилглиоксима, дитизона, 8-оксихинолина и др., а также краун-эфиры.

Наибольшее применение в ионообменной, ионной и ион-парной хроматографии находят синтетические макро- и микросетчатые органические ионообменники, имеющие большую обменную емкость (3–7 ммоль/г), а также неорганические ионообменные материалы. Микросетчатые ионообменники способны к обмену ионов только в набухшем состоянии, макросетчатые – в набухшем и ненабухшем состояниях. Другим структурным типом ионообменников являются поверхностно-пленочные иониты, твердая сердцевина которых изготовлена из непористого сополимера стирола и дивинилбензола, стекла или силикагеля и окружена тонкой пленкой ионообменника. Общий диаметр такой частицы составляет около 40 мкм, толщина пленки ионита – 1 мкм. Недостаток таких ионообменников – сравнительно большой диаметр частиц и малая обменная емкость из-за низкой удельной поверхности, вследствие чего приходится работать с малыми пробами и, соответственно, использовать высокочувствительные детекторы. Кроме того, такие ионообменники достаточно быстро отравляются и не способны к регенерации.

В высокоэффективной ионообменной и ионной хроматографии применяют объемно-пористые полистирольные ионообменники, объемно-пористые кремнеземы с диаметром гранул около 10 мкм, а также практически не набухающие поверхностно-пористые и поверхностно-модифицированные сополимеры стирола и дивинилбензола с ионогенными сульфо- и аминогруппами.

В ион-парной хроматографии используют «щеточные» сорбенты – силикагели с привитыми обращенными фазами С 2 , С 8 ,С 18 , которые легко превращаются в катионообменник при поглощении из подвижной фазы ионогенных поверхностно-активных веществ, например алкилсульфатов или солей четвертичных аммониевых оснований.

При проведении хроматографического разделения с применениием ионообменников в качестве подвижной фазы чаще всего используют водные растворы солей. Это связано с тем, что вода обладает прекрасными растворяющими и ионизирующими свойствами, благодаря чему молекулы анализируемой пробы мгновенно диссоциируют на ионы, ионообменные группы ионообменника гидратируются и также переходят в полностью или частично диссоциированную форму. Это обеспечивает быстрый обмен противоионов. На элюирующую силу подвижной фазы основное влияние оказывает рН, ионная сила, природа буферного раствора, содержание органического растворителя или поверхностно-активного вещества (ион-парная хроматография).

Значение рН выбирают в зависимости от природы ионогенных групп, разделяемых ионов и матрицы. С сильнокислотными и сильноосновными ионообменниками можно работать при рН = 2–12, со слабокислотными при рН = 5–12, со слабоосновными при рН = 2–6. Сорбенты на основе кремнезема при рН 9 использовать нельзя. Ионная сила подвижной фазы влияет на емкость ионообменника. С увеличением ионной силы сорбция ионов обычно уменьшается, так как растет элюирующая сила подвижной фазы. Поэтому в начале разделения подвижная фаза должна иметь малое значение ионной силы (0,05–0,1), а конечное значение этой характеристики не должно превышать 2. При градиентном элюировании часто используют буферы с увеличивающейся ионной силой.

Для селективного элюирования ионов, поглощенных ионообменником, можно применять воду, буферные растворы (фосфатный, ацетатный, боратный, гидрокарбонатный и др.) с определенным значением рН и ионной силы, растворы минеральных (соляная, азотная, серная, фосфорная) и органических (фенол, лимонная, молочная, винная, щавелевая, ЭДТА) кислот. Выбор элюента облегчается тем, что предельные коэффициенты распределения большинства элементов между водными (водно-органическими) растворами многих комплексантов и ионообменниками стандартного типа определены и представлены в таблицах.

1.6.4. Эксклюзионная хроматография. Эксклюзионная хроматографияэто разновидность жидкостной хроматографии, в которой разделение компонентов основано на распределении молекул в соответствии с их размером между растворителем, находящимся в порах сорбента, и растворителем, протекающим между его частицами. В процессе разделения небольшие молекулы попадают в сетку полимера, в порах которой растворитель служит неподвижной фазой, и удерживаются там. Большие молекулы не могут проникнуть в полимерную сетку и вымываются из колонки подвижной фазой. Вначале элюируются самые большие, затем средние и, наконец, небольшие молекулы.

Эксклюзионная хроматография подразделяется на гель-про-никающую и гель-фильтрационную. В гель-проникающей хроматографии разделение происходит на полимерах, набухающих в органических растворителях. Гель-фильтрационный вариант эксклюзионной хроматографии предполагает использование в качестве неподвижных фаз полимеров, набухающих в воде.

Продолжительность удерживания компонентов анализируемой пробы в эксклюзионной колонке зависит от размеров их молекул и диффузии в поры сорбента, а также от размеров пор неподвижной фазы.

В этом виде жидкостной хроматографии коэффициент распределения D для самых маленьких молекул анализируемой пробы, которые движутся в хроматографической колонке с наименьшей скоростью, проникая в сетку неподвижной фазы, равен 1, так как подвижная фаза и растворитель, находящийся в порах неподвижной фазы, имеют один и тот же состав. При этом основное уравнение колоночной хроматографии приобретает вид

Молекулы большого размера, не попадающие в поры неподвижной фазы, элюируют из колонки вместе с подвижной фазой. Для них D = 0, aV R =V m . Такой диапазон значений коэффициента распределения (от 0 до 1) характерен только для эксклюзионной хроматографии.

Все молекулы анализируемого многокомпонентного вещества должны вымываться из колонки при пропускании небольшого объема растворителя от V m доV m +V s и разделение заканчивается до выхода пика растворителя. Поэтому в этом виде хроматографии необходимо использовать достаточно длинные колонки с большим свободным объемомV m и большим числом пор в сорбенте.

Разрешение хроматографических пиков при эксклюзионном разделении может быть улучшено при использовании градиентного элюирования смешанными растворителями.

Каждый сорбент, применяемый в эксклюзионной хроматографии, характеризуется определенным объемом пор и, следовательно, обладает определенной областью разделяемых молекулярных масс и определенным градуировочным графиком. При этом градуировочный график, характеризующий зависимость удерживаемого объема от молекулярной массы или размера молекул, имеет, как правило, сложный вид.

Неподвижные фазы в эксклюзионной хроматографии выбирают исходя из конкретных аналитических задач. Первоначально устанавливают, какая система растворителей может быть использована для анализа (водная или водно-органическая). В зависимости от этого определяют тип сорбента. Если необходимо провести разделение водорастворимых проб, в качестве неподвижных фаз применяют, например, набухающие в воде сшитые декстраны (сефадексы) или полиакриламиды (биогель Р). Разделение веществ, растворимых в органических растворителях, можно проводить на полистиролах с различной степенью сшивки, набухающих в органических растворителях (стирогель, порагель, биобид С). Такие набухшие гели, как правило, неустойчивы к давлению, при их использовании допускаются очень низкие скорости потока подвижной фазы, что увеличивает время анализа. Чтобы осуществить высокоэффективный вариант эксклюзионной хроматографии, необходимо применять неподвижные фазы с жесткими матрицами силикагели, недостаток которыхвысокая адсорбционная активность – устраняется силанизацией поверхности или подбором соответствующего по полярности элюента.

В качестве подвижных фаз в эксклюзионной хроматографии могут использоваться вещества, которые:

 полностью растворяют анализируемый образец;

 хорошо смачивают сорбент;

 противодействуют адсорбции компонентов пробы на сорбенте;

 имеют низкую вязкость и токсичность.

1.6.5. Плоскостная хроматография . К плоскостной хроматографии относятся тонкослойная и бумажная хроматографии. Эти виды жидкостной хроматографии просты по технике выполнения, экспрессны, не требуют дорогостоящего оборудования, что является их неоспоримым достоинством.

Разделение смеси веществ этими методами может быть выполнено с использованием различных хроматографических систем. Поэтому выделяют адсорбционную, распределительную, нормально- и обращенно-фазовую, ионообменную и т. п. бумажную и тонкослойную хроматографии. В настоящее время наибольшее распространение получила тонкослойная хроматография.

Бумажная и тонкослойная хроматографии сходны по технике выполнения. В качестве неподвижной фазы в бумажной хроматографии применяется целлюлозное волокно бумаги, в тонкослойной хроматографии различные сорбенты (Al 2 O 3 , силикагель и др.), нанесенные равномерным тонким (100300 мкм) слоем на стеклянную, металлическую или пластиковую подложку (носитель). Слой адсорбента на носителе может быть закреплен или не закреплен.

Хроматографическое разделение в плоскостных методах, как и на колонке, обусловлено переносом компонентов анализируемого вещества подвижной фазой вдоль слоя неподвижной фазы с различными скоростями в соответствии с коэффициентами распределения разделяемых веществ. В обоих случаях используются хроматографические системы жидкость твердый сорбент (адсорбционный механизм разделения), жидкостьжидкостьтвердый носитель (распределительный, ионообменный и другие механизмы).

В качестве подвижных фаз применяют различные растворители или их смеси, органические или неорганические кислоты.

Практическое получение плоскостных хроматограмм состоит в следующем.

На полоске хроматографической бумаги или на тонком слое сорбента карандашом отмечают стартовую линию на расстоянии 1 см от нижнего края полоски или пластинки. Микропипеткой наносят пробу на линию старта в виде пятна диаметром не более 23 мм. Затем край полоски или пластинки опускают в сосуд с подвижной фазой, находящийся в герметичной камере. По мере подъема подвижной фазы по полоске или пластинке и протекания обычных в хроматографии многократных элементарных актов сорбции-десорбции, распределения между двумя жидкими фазами, ионного обмена и др. происходит разделение компонентов анализируемой смеси. Процесс обычно продолжают до тех пор, пока растворитель не пройдет от линии старта10 см. После этого полоску или пластинку извлекают из камеры и высушивают. Если компоненты анализируемого вещества окрашены, они дают на хроматограмме соответствующие цветные пятна. Для обнаружения неокрашенных компонентов анализируемого вещества хроматограмму необходимо проявить. Проявление хроматограммы и детектирование компонентов пробы может быть проведено различными методами и зависит от состава анализируемых смесей. Проявление может быть осуществлено:

 с помощью УФ-освещения. Метод применим для обнаружения веществ, способных под действием УФ-излучения испускать собственное излучение (люминесцировать) видимого диапазона длин волн;

 посредством реагентов-проявителей. Например, присутствие в анализируемой смеси аминокислот может быть обнаружено с помощью нингидрина. Высушенную хроматограмму погружают в 0,2%-ный раствор нингидрина в ацетоне, затем высушивают ее. Пятна, соответствующие различным компонентам смеси, приобретают визуальную и, как правило, специфичную для каждого вещества окраску;

 с использованием иода. При этом детектируемую хроматограмму вносят в сосуд, на дне которого находятся кристаллы иода. Пары иода адсорбируются на пятнах сильнее, благодаря чему пятна визуализируются. Иод это неспецифический реагент-проявитель. Используя специфические реагенты, можно не только определить количество компонентов смеси, но и идентифицировать разделенные вещества по цвету пятен.

Бумажную и тонкослойную хроматографии чаще всего осуществляют в так называемом восходящем варианте, описанном выше. Достаточно часто для улучшения качества хроматограмм приходится использовать и более сложные варианты плоскостной хроматографии, например, нисходящую, круговую, двухмерную. При проведении нисходящей бумажной или тонкослойной хроматографии анализируемое вещество наносится на стартовую линию пластинки или бумажной полоски, находящейся сверху, и элюент подается не снизу, а сверху. Положительный эффект, заключающийся в улучшении разделения, обусловлен вкладом в процесс разделения сил тяжести компонентов.

Как восходящая, так и нисходящая хроматографии могут быть осуществлены в одно и двухмерном вариантах. В отличие от описанного выше одномерного процесса разделения в плоском слое при двухмерном хроматографическом разделении разделение анализируемой пробы сначала проводят в одном растворителе, затем осуществляют разделение в направлении, перпендикулярном первому, с использованием другого растворителя, повернув первую хроматограмму на 90 о С.

При проведении круговой хроматографии анализируемое вещество наносится в виде капли в середину пластинки или листа хроматографической бумаги. Сюда же каплями подается один или несколько растворителей. Это приводит к тому, что получаемая хроматограмма представляет собой набор радиальных пятен.

Положение пятен (зон), которые образуют разделенные компоненты анализируемого вещества на плоской хроматограмме, характеризуется величинами относительной скорости перемещения компонентов в тонком слое R fi . Экспериментально величинуR fi определяют как отношение расстоянияL i , пройденногоi -м компонентом, к расстояниюL , пройденному растворителем от стартовой линии до линии фронта (рис. 1.10):

Величина R fi зависит от природы соответствующего компонента анализируемой пробы, природы неподвижной фазы, ее толщины, природы и качества подвижной фазы, способа нанесения пробы и других факторов, но всегдаR fi 1.

Величина R fi фактически тождественна времени удерживания вещества или его удерживаемому объему, характеризующим скорость прохождения вещества через хроматографическую колонку, и может быть использована для качественной идентификации компонентов анализируемой пробы, а диаметр пятна тождественен высоте или площади хроматографического пика и, следовательно, в некоторой степени отражает количественное содержание вещества.

Количественное определение состава анализируемой пробы в простейшем случае может быть оценено визуально по интенсивности собственной окраски пятен или интенсивности флуоресцентного свечения полученных пятен при УФ-детектировании. Для этих целей достаточно широко применяется элюирование хроматографических пятен. При этом пятно, полученное на хроматограмме, аккуратно вырезают или соскребают, обрабатывают подходящим растворителем и полученный раствор исследуют соответствующим физико-химичес-ким методом. Можно использовать и весовой метод, при котором соответствующее пятно вырезают из хроматограммы и взвешивают. Количество вещества определяют по разности весов чистой бумаги такой же площади и бумаги с веществом.

Бумажная (БХ ) и тонкослойная хроматография (ТСХ ) по механизму разделения относятся к распределительной хроматографии . В методе БХ носителем является специальная хроматографическая бумага с определенными свойствами. Неподвижной фазой служит вода, адсорбированная на поверхности и порах бумаги (до 20%), подвижной  органический растворитель, смешивающийся или несмешивающийся с водой, вода или растворы электролитов.

Механизм на бумаге довольно сложен. В неподвижной фазе вещество может удерживаться не только вследствие растворения в адсорбированной бумагой воде, но и адсорбироваться непосредственно целлюлозой. Нанесенные на бумагу разделяемые компоненты переходят в подвижную фазу и по капиллярам бумаги перемещаются с различными скоростями в соответствии с коэффициентом межфазного распределения каждого из них. В начале хроматографирования некоторая часть вещества из бумаги переходит в подвижную фазу и перемещаются далее. Когда органический растворитель достигает участка бумаги, не содержащего растворенное вещество, снова происходит перераспределение : из органической фазы вещество переходит в водную, сорбированную на бумаге. Поскольку компоненты обладают различным сродством к сорбенту , при перемещении элюента происходит разделение: одни вещества задерживаются в начале пути, другие продвигаются далее. Здесь сочетаются термодинамический (установления равновесного распределения веществ между фазами) и кинетический (движение компонентов с различной скоростью) аспекты разделения. В результате каждый компонент концентрируется на определенном участке бумажного листа: образуются зоны отдельных компонентов на хроматограмме . Использование хроматографии на бумаге имеет ряд существенных недостатков: зависимость процесса разделения от состава и свойств бумаги, изменение содержания воды в порах бумаги при изменении условий хранения, очень низкая скорость хроматографирования (до нескольких суток), низкая воспроизводимость результатов. Эти недостатки серьезно влияют на распространение хроматографии на бумаге как хроматографического метода.

В методе ТСХ процесс разделения смеси веществ осуществляется в тонком слое сорбента , нанесенного на инертную твердую подложку, и обеспечивается движением подвижной фазы (растворителя) через сорбент под действием капиллярных сил . По механизму разделения различают распределительную, адсорбционную и ионообменную хроматографию . Разделение компонентов происходит в этих случаях либо в результате их различного коэффициента распределения между двумя жидкими фазами (распределительная хроматография ), либо вследствие различной адсорбируемости соединений сорбентом (адсорбционная хроматография ). Адсорбционный метод основан на разной степени сорбции-десорбции разделяемых компонентов на неподвижной фазе. Адсорбция осуществляется за счет ван-дер-ваальсовских сил , являющейся основой физической адсорбции , полимолекулярной (образование нескольких слоев адсорбата на поверхности адсорбента) и хемосорбцией (химического взаимодействия адсорбента и адсорбата).

В случае использования для ТСХ таких сорбентов, как окись алюминия или силикагель в разделении играют роль как распределение , так и адсорбция на развитой активной поверхности сорбента (150 750 м 2 /г). Распределение компонентов смеси происходит между водой на поверхности носителя (такие адсорбенты , как окись алюминия , крахмал , целлюлоза , кизельгур – и вода образуют неподвижную фазу ), и перемещающимся через эту неподвижную фазу растворителем (подвижная фаза ). Компонент смеси, легче растворимый в воде, перемещается медленнее, чем тот, который легче растворим в подвижной фазе.

Адсорбция проявляется в том, что между носителем , например, окисью алюминия, и компонентами смеси устанавливаются адсорбционные равновесия – для каждого компонента свое, результатом чего является разная скорость перемещения компонентов смеси. Можно выделить два крайних случая:

а) концентрация вещества на адсорбенте равна нулю. Вещество полностью растворяется в подвижной фазе и увлекается ею (перемещается вместе с фронтом растворителя ).

б) вещество адсорбируется полностью, с растворителем не взаимодействует и остается на старте.

На практике при умелом подборе растворителя и адсорбента распределение соединения располагается между этими крайними случаями, и вещество постепенно переносится от одного слоя сорбента к другому за счет одновременно происходящих процессов сорбции и десорбции .

Растворитель, проходящий через сорбент, называют элюентом , процесс перемещения вещества вместе с элюентом  элюированием . По мере продвижения жидкости на пластинке происходит разделение смеси веществ благодаря действию сил адсорбции , распределения , ионного обмена или совокупности действия всех перечисленных факторов. В результате образуются отдельные хроматографические зоны компонентов смеси, т.е. получается хроматограмма .

Правильный подбор сорбента и элюента определяет эффективность разделения смеси. Подвижность исследуемого вещества зависит от его сродства к сорбенту и элюирующей силы (полярности) элюента. С увеличение полярности соединения растет и его сродство к полярному сорбенту. По увеличению степени адсорбции силикагелем органические соединения располагаются в ряд: углеводороды <алкилгалогенидыарены<нитросоединения<простые эфиры <сложные эфиры<альдегиды<спирты<амины<карбоновые кислоты. В свою очередь для силикагеля элюенты можно расположить в порядке возрастания «полярности» (элюирующей способности ) и сформировать серию растворителей (элюотропный ряд ) в соответствии с экспериментальными данными: алканы>бензол>хлороформ>диэтиловый эфир> этилацетат>спирты С 2 -С 4 >вода>ацетон>уксусная кислота>метанол. Таким образом, полярное соединение – спирт достаточно сильно адсорбируется на силикагеле и поэтому слабо перемещается под действием такого неполярного растворителя, как гексан, и остается около линии старта. В свою очередь неполярный ароматический углеводород бифенил заметно более подвижен в гексане, но даже здесь для достижения R f около 0,5 необходим более полярный апротонный элюент – хлористый метилен. Силу элюента регулируют, используя смеси растворителей – соседей по элюотропному ряду с разной полярностью.

В настоящее время в ТСХ применяют главным образом следующие сорбенты : для разделения липофильных веществ  силикагель , окись алюминия , ацетилированную целлюлозу , полиамиды ; для разделения гидрофильных веществ  целлюлозу , целлюлозные ионообменники , кизельгур , полиамиды . Важнейшей характеристикой сорбента является его активность , т.е. способность сорбировать (удерживать) компоненты разделяемой смеси. За рубежом ряд фирм производит силикагель , кизельгур и окись алюминия с добавкой 5% гипса, который используется для закрепления слоя сорбента при самостоятельном изготовлении пластин.

Наиболее распространенным сорбентом является силикагель - гидратированная кремниевая кислота, образующаяся при действии минеральных кислот на Na 2 SiO 3 и сушкой образовавшегося золя. После размалывания золя используют фракцию определенной зернистости (указанную на пластинке, обычно 5-20 мкм). Силикагель является полярным сорбентом c группами ОН в качестве активных центров. Он легко сорбирует на поверхности воду и образует водородные связи.

Окись алюминия является слабоосновным адсорбентом и используется в основном для разделения соединений слабоосновного и нейтрального характера. Недостатком пластин на окиси алюминия является обязательная активация поверхности перед использованием в сушильном шкафу при высокой температуре (100150 о С) и низкая, по сравнению с силикагелем адсорбционная емкость слоя.

Кизельгур  адсорбент, полученный из природных минералов  диатомовых земель. Сорбент обладает гидрофильными свойствами и более низкой адсорбционной емкостью слоя в сравнении с силикагелем.

Целлюлоза: тонкослойные пластины с нанесенной целлюлозой очень эффективны для разделения сложных органических молекул. Адсорбент представляет собой в основном шарики целлюлозы диаметром до50 мкм, закрепленные на носителе крахмалом. Как и в бумажной хроматографии, подъем фронта растворителя происходит очень медленно.

Хроматографический анализ выполняется на промышленных пластинах чешского производства «Силуфол » («Silufol ») из алюминиевой фольги, иногда укрепленной картоном, и «Силупласт » из пластмассы, покрытых слоем сорбентов – силикагеля LS 5-40 с крахмалом или гипсом в качестве связующего (до 10%), или оксида алюминия с добавлением и без флуоресцентных индикаторов. Пластинки «Силуфол » имеют высокую скорость элюирования, однако при этом характеризуются низкой разделяющей способностью и невысокой чувствительностью. При хранении чувствительны к условиям (влажность, температура, агрессивные среды и т.п.). Отдельные фирмы поставляют хроматографические пластинки со слоем сорбента различной (обычно до 0,25 мм), но строго постоянной толщины (силикагель, целлюлоза, ионообменная смола), на стекле и подложках из алюминиевой фольги, пластмассы, пропитанного стекловолокна.

Пластины «Sorbfil » (ТУ 26-11-17-89) выпускаются в России на полимерной основе (полиэтилентерефталат, марка П) или алюминиевой подложке (марка АФ) с нанесенным рабочим слоем микрофракционированного сорбента силикагеля марки СТХ-1А и СТХ-1ВЭ (выпускался в СССР как фракционированный силикагель КСКГ) толщиной 90-120 мкм (до 200 мкм), закрепленным специальным связующим - силиказолем . При использовании в качестве связующего золя кремневой кислоты (силиказоля), который после нагревания переходит в силикагель, полученные ТСХ-пластины состоят из двух компонентов: слоя силикагеля и подложки. Равномерность по толщины слоя сорбента на одной пластине составляет ±5 мкм. Пример обозначения: "Сорбфил-ПТСХ-АФ-В-УФ (10х10)" - пластинки для ТСХ высокоэффективные на алюминиевой подложке, с люминофором, 10х10 см.

Если применять стеклянную подложку (марка С), то такие пластины являются многоразовыми и химически прочными. Их химическая устойчивость определяется химической стойкостью силикагеля. В результате ТСХ-пластины могут многократно обрабатываться агрессивными реагентами, например, горячей хромовой смесью, что снимает ограничения в использовании коррелирующих реагентов для детектирования пятен и модификации сорбента, и позволяет проводить многократную (до 30 раз и более) регенерацию пластин хромовой смесью. Стеклянные пластинки могут быть нарезаны по необходимым размерам. Механическая прочность слоя сорбента может регулироваться, обеспечивая, с одной стороны, транспортировку и многократность обработки пластин и, с другой стороны, возможность экстракции слоев адсорбента с разделившимися веществами для последующего вымывания индивидуальных соединений из сорбента и их дальнейшего исследования инструментальными методами (ИК и УФ-спектрометрии, рентгено-структурными методами, ЯМР и т.д.).

Пластины различаются величиной фракций (распределения частиц) силикагеля, из которого состоит слой. На аналитических пластинах (марка А) фракция 5-17 мкм, на высокоэффективных (марка В) - 8-12 мкм. Более узкое распределение повышает эффективность пластин, т.е. пятна разделяемых веществ становятся более компактными (меньшими по размерам) и поэтому лучше разделяются при прохождении фронта элюента на более короткое расстояние. На российских пластинах аналитические и высокоэффективные слои различаются не очень сильно, в отличие от пластин фирмы Merck (Германия). Применять высокоэффективные пластины нужно, если вещества не разделяются на аналитических пластинах. Выпускаются пластины всех модификаций с люминофором (марка УФ) с возбуждением 254 нм. Срок хранения не ограничен, пластины «Sorbfil » широко испытаны в анализе производных аминокислот, пестицидов, липидов, антибиотиков.

Методом ТСХ осуществляется качественная идентификация компонентов. Количественное определение для ТСХ также возможно, для этого требуется нанесение точного количества вещества и дополнительные денситометрические исследования с четким фиксированием интенсивности пятен. Наиболее распространенным является полуколичественный метод . Он основан на визуальном сравнении размера и интенсивности пятна компонента с соответствующими характеристиками серии пятен этого же вещества различной концентрации (стандартные растворы сравнения ). При использовании пробы в количестве 1-5 мкг таким простым методом обеспечивается точность определения содержания компонента около 5-10%. Нередко для определения компонентов в образце необходимо провести пробоподготовку для получения смеси, содержащей анализируемые соединения. Пробоподготовка основана на извлечении препаратов из образца органическими растворителями (н -гексан, петролейный эфир, диэтиловый эфир, хлороформ), очистке экстракта и последующем хроматографировании в тонком слое окиси алюминия или силикагеля.

Существует несколько вариантов ТСХ и БХ, различающихся способом подачи растворителя . В зависимости от направления движения подвижной фазы различают:

а) восходящую хроматографию  подвижную фазу наливают на дно разделительной камеры, бумага (пластинка) ставится вертикально;

б) нисходящую хроматографию  подвижная фаза подаётся сверху и перемещается вниз вдоль слоя сорбента пластины или бумаги;

в) радиальную хроматографию  горизонтальное продвижение фронта растворителя: подвижная фаза подводится к центру бумажного диска (пластины), куда нанесена разделяемая смесь.

Наиболее распространенным является восходящее элюирование (хроматографирование). Фронт элюента при этом перемещается снизу вверх. Выбор растворителя (подвижной фазы) определяется природой сорбента и свойствами разделяемых веществ.

Хроматографическое разделение методами БХ и ТСХ проводят в разделительной камере с притёртой крышкой. Количественной мерой скорости переноса вещества при использовании определенного адсорбента и растворителя является величина R f (от англ. retention factor – коэффициент задержки, этот параметр является аналогией времени удерживания). Положение зоны хроматографируемого компонента устанавливают по величине коэффициента R f , равной отношению скорости движения его зоны к скорости движения фронта растворителя. Величина R f всегда меньше единицы и не зависит от длины хроматограммы. На величину R f оказывают влияние различные факторы. Так, при низкой температуре вещества перемещаются медленнее; загрязнения растворителей, негомогенность адсорбента, посторонние ионы в анализируемом растворе могут изменять величину R f до 10%. В выбранной системе анализируемые вещества должны иметь различные значения R f и распределяться по всей длине хроматограммы. Желательно, чтобы значения R f лежало в пределах 0,05-0,85.

На практике величину R f рассчитывают как отношение расстояния l , пройденного веществом, к расстоянию L , пройденному растворителем:

R f = l / L (6.1 )

Обычно для расчета выбирают центр пятна (рис. 1). Величина R f зависит от многих факторов: типа хроматографической бумаги (ее пористости, плотности, толщины, степени гидратации) и сорбента (размера зерен, природы групп на поверхности, толщины слоя, его влажности, природы вещества, состава подвижной фазы), условий эксперимента (температуры, времени хроматографирования и т.п.). При постоянстве всех параметров хроматографирования значение R f определяется только индивидуальными свойствами каждого компонента.

Рис. 1. Определение на хроматограмме величин Rf для компонентовА иВ ,

степени их разделения Rs и числа теоретических тарелокN .

Эффективность БХ и ТСХ также зависит от селективности и чувствительности реакций, используемых для обнаружения компонентов анализируемой смеси. Обычно используют реагенты, образующие с определяемыми компонентами окрашенные соединения  проявители. Для более надёжной идентификации разделяемых компонентов применяют «свидетели » растворы стандартных веществ (в том же растворителе, что и проба), наличие которых предполагается в образце. Стандартное вещество наносят на стартовую линию рядом с анализируемой пробой и хроматографируют в одинаковых условиях. На практике часто используют относительную величину:

R f rel = R f x / R f stand (6.2)

где R f stand также рассчитывают по формуле (6.1). Эффективность хроматографического разделения характеризуют числом эквивалентных теоретических тарелок и их высотой . Так, в методе ТСХ число эквивалентных теоретических тарелок N А для компонента А разделяемой смеси рассчитывают по формуле:

N A = 16 (l OA / a (A )) 2 (6.3)

Значения l OA и а (А ) определяют, как показано на рис. 6.1. Тогда высота эквивалентной теоретической тарелки Н А составляет:

H A = l OA / N = a (A ) 2 / 16 l OA . (6.4)

Разделение практически возможно, если R f (А)  R f (В)  0,1 .

Для характеристики разделения двух компонентов А и В используют степень (критерий) разделения Rs :

Rs =  l / (a (A) / 2 + a (B) / 2)= 2  l / (a (A) + a (B)) (6.5)

где  l  расстояние между центрами пятен компонентов А и В ;

а (А) и а (В)  диаметры пятен А и В на хроматограмме (рис. 6.1). Чем больше Rs , тем чётче разделены пятна компонентов А и В на хроматограмме. Условия хроматографирования подбирают так, чтобы величина Rs отличалась от нуля и единицы, оптимальное значение Rs составляет 0,3 0,7. Для оценки селективности разделения двух компонентов А и В используют коэффициент разделения α :

α = l B / l A (6.6)

Если α = 1, то компоненты А и В не разделяются.