Процессинг у эукариот затрагивает все виды первичных транскриптов эукариотических генов.

Процессинг у эукариот

Кэпирование представляет собой образование на 5"-конце мРНК особой структуры - кэпа (шапочки). Кэпирование происходит еще до полного завершения транскрипции и защищает 5"-конец РНК от действия нуклеаз. Кэпирование РНК осуществляется с участием GTP(гуанозинтрифосфата ), из состава которого GMP переносится на 5"-дифосфат первого нуклеотида мРНК.

Полиаденилирование осуществляется, ферментом поли(А)-полимеразой и приводит к образованию на З"-конце олиго(А)-фрагмента, содержащего 100 - 200 остатков адениловой кислоты подряд и называемого также «поли(А)-хвостом». Эта поли (А)-последовательность добавляется к РНК после присоединения кэпа . Сначала 3"-конец РНК отщепляется ферментами в точке, отстоящей на 10-35 рибонуклеотидов от консервативной последовательности ААUААА, а затем происходит полиаденилирование этого конца молекулы РНК. Поли(А)-хвост находят практически у всех мРНКэукариотических ороганизмов, за исключением транскриптов гистоновых генов. Последовательность ААUААА встречается не во всех эукариотических РНК-транскриптах. По-видимому, это связано с мутациями, препятствующими полиаденилированию. В отсутствие 3"- хвоста РНК-транскрипты быстро деградируют под действием ферментов.

Т.о. 5"-кэп и 3"-хвост чрезвычайно важны для дальнейшего процессинга и транспортировки мРНК в цитоплазму. Поли(А)-хвост определяет стабильность мРНК и время ее жизни в клетке. Кроме того, способствует выходу мРНК из ядра в цитоплазму, а также существенен для регуляции трансляции.

Механизмы сплайсинга: автокатализ РНК (Клаг,400)

Для разных типов ядерной РНК, а также для РНК мтх и хлп существуют свои собственные механизмы сплайсинга.

В зависимости от специфичности механизма сплайсинга, интроны можно разделить на несколько групп. К первой группе относятся интроны, входящие в состав первичного рРНК-транскрипта, для удаления которых не требуется дополнительных компонентов. Эти интроны сами обладают ферментативной активностью, необходимой для их вырезания. Впервые этот факт был обнаружен в 1982 г (Томас Чех с сотр.) у жгутикового простейшего тетрахимены (Tetrachymena). Из-за автокаталитических свойств самосплайсирующиеся РНК иногда называют рибозимами .

Процесс самовырезания (автоэсцизия) (рис. 145_Коничев)

(рис.12-12, Клаг) представляет собой две нуклеофильные реакции, или реакции трансэтерификации, в которых гуанозин взаимодействует с первичным итранскриптом и действует как кофактор. При этом З"-гидроксильная группа гуанозина переносится на нуклеотид, примыкающий к 5"-концу интрона. Во второй реакции эта гидроксильная группа взаимодействуетс фосфатной группой на З"-конце правого интрона, в результате интрон вырезается, а концы двух соседних экзонов соединяются с образованием зрелой мРНК.

Интрон 26S рРНК тетрахимены - IVS, состоит из 413 нуклеотидов. В результате реакции трансэтерификации без дополнительных затрат энергии осуществляется лигирование двух экзонов с образованием зрелой 26S рРНК. Вырезанный интрон затем циклизуется. Из его состава путем двухэтапного ауторасщепления освобождается фрагмент, содержащий 19 нуклеотидов, в результате чего образуя РНК длиной 376 нуклеотидов (L -19 IVS), которая и представляет собой истинный РНК-фермент (рибозим ), обладающий каталитическими свойствами. Этот рибозим обладает устойчивой структурой, имеет эндонуклеазную активность, расщепляя длинные одноцепочечные РНК, и проявляет специфичность, распознавая в о составе атакуемого субстрата тетрануклеотиды CUCU . В структуре интронов типа I выявлены характерные внутренние олигопуриновые последовательности (у тетрахимены это последовательность GGAGGG), называемые адапторными последовательностями , которые участвуют в образовании активного центра РНК-ферментов и выполняют важнейшую роль в каталитическом расщеплении РНК.

Такое самовырезание интронов характерно для пре-рРНК других простейших. Этот механизм, по-видимому, действует и при удалении интронов из первичных транскриптов иРНК и тРНК в митохондриях и хлоропластах , которые относятся к группе II .

Для вырезания интроноввторой группы также необходимы две автокаталитические реакции, но гуанозин не требуется.

Дальнейшие исследования позволили установить, что каталитической активностью обладают не только крупные РНК (~400 нуклеотидов у тетрахимены и РНКазы Р), но и короткие 13 -20-членные олигонуклеотиды, которые могут быть синтезированы in vitro. Такие рибозимы стали называть минизимами . Одна из детально исследованных моделей функционирования таких рибозимов получила название «головка молотка » (рис. 146). Третичная структура «головки молотка» стабилизируется ионами двухвалентных металлов, которые нейтрализуют отрицательно заряженные атомы кислорода фосфодиэфирных связей и одновременно соединяют фосфатные группы ковалентными связями, что существенно для образования стабильного переходного состояния (фермент-субстратного комплекса). Как и в случае катализа, осуществляемого ферментами белковой природы, рибозимы и атакуемый субстрат

(природные или синтетически полученные молекулы РНК) образуют фермент-субстратный комплекс, а затем - фермент-продуктный комплекс (см. рис. 146).

Механизмы сплайсинга: сплайсосома. (Процессинг мРНК у эукариот)

В ядерных пре-мРНК интроны могут достигать в длину 20 000 нуклеотидов. Поэтому их удаление требует более сложного механизма, чем самовырезание (автоэксцизия). (рис.12-13). Нуклеотидные последовательности на концах интронов в этих молекулах сходны: на 5"-концах часто находится динуклеотид (GU) ГУ, а на З"-конце – динуклеотид (AG) АГ. C этими последовательностями связываются молекулы специальных белков, которые формируют комплекс, называемый сплайсомой . Основной компонент сплайсосом – малые ядерные рибонуклеопротеины, или мяРНП , которые найдены только в ядре и обогащены остатками уридина. Поэтому малые ядРНК часто обозначают U1 , U2 …U6.

[Коничев, с.292. В сплайсинге пре-мРНК

у высших эукариот задействован ряд белков, а также РНК особого вида – малые ядерные РНК (мяРНК). Малые ядерные РНК имеют последовательности протяженностью от 65 до 1000 и более нуклеотидов (10S -90S), богатые уридиловыми нуклеотидами, и поэтому называются также uPHK (Ul, U2 и т.д.). У дрожжей выявлено 25 различных мяРНК, у позвоночных животных - 15. У шпорцевых лягушек Xenopus laevis ряд мяРНК (U3, U8, U14 и U22) участвуют в процессинге рибосомальных РНК, связываясь с пограничными участками спейсерных последовательностей (см. рис. 143). Малые ядерные РНК выявлены не только у позвоночных животных и дрожжей, но также у насекомых и архибактерий. Они представляют собой, вероятно, очень древнюю группу молекул. Нуклеотидная последовательность всех соответствующих uPHK

эукариот совпадает более чем на 90 %, что, в частности, относится к U1 человека и дрозофилы. Высокий консерватизм структуры uPHK говорит о том, что сплайсинг представляет собой очень древний процесс, начавшийся с аутосплайсинга (см. выше) и трансформировавшийся в сплайсинг с участием особых рибонуклеопротеидных частиц - мяРНП. Гены мяРНК транскрибируются РНК-полимеразой II и имеют различную локализацию в геноме: часть из них представляет собой дискретные независимые гены,

не имеющие интронов, тогда как гены других мяРНК располагаются внутри интронов генов, кодирующих белки. Так, у Xenopus U13 кодируется тремя уникальными последовательностями, находящимися

в интронах 5, 6 и 8 генов белков теплового шока, а ген U16 находится внутри интрона рибосомального белка L1. Последнее обстоятельство имеет важное значение, так как показывает, что процессинг рРНК и процессинг мРНК белков рибосом может быть скоординирован при участии мяРНК. Кроме того,

предполагают, что мяРНК способны служить РНК-шаперонами, участвуя в фолдингерРНК, т.е. помогая ей принять необходимую структуру в пространстве. Малые ядерные РНК присутствуют в ядрах в комплексах с белками, получившими название малыерибонуклеопротеиновые частицы (мяРНП). Стабильным компонентом мяРНП является белок фибрилларин - очень консервативный по структуре белок с молекулярной массой 34 кДа, локализованный в ядрышках. Комплекс, состоящий из множества мяРНП, который катализирует сплайсинг ядерных про-мРНК, носит название сплайсингосомы .]

Известно, мяРНК типа U 1, содержит нуклеотидную последовательность, гомологичную 5"-концу интрона. Спаривание этих последовательностей дает начало сплайсоме. Затем к ней присоединяется мяРНК типа U2 , U4 , U5 и U6 начинается сплайсинг. Как и в случае интронов первой группы происходит две реакции трансэтерификации. Сначала З"- гидроксильная группа аденина (А), локализованного в интроне, взаимодействует с 5"-сайтом сплайсинга, разрезая цепь РНК. Затем несколько мяРНП формируют промежуточный комплекс и начинается вторая реакция: свободный 5"-конец интрона соединяется с остатком аденина. В результате формируется характерная петлеобразная структура типа лассо, содержащая удаленный интрон. Затем концы экзонов лигируют и комплекс мяРНК освобождает транскрипт.

[ Коничев, с.294. Взаимодействие разных мяРНК, входящих в состав сплайсингосомы, со сплайсируемой пре-мРНК в 5"- и З"-сайтах сообщает интрону петлеобразную структуру. При этом сближаются концы экзонов, чему способствует образование неканонических (отличающихся от уотсон-криковских пар) водородных связей между двумя гуанинами, содержащимися в 5"- и З"-сайтах сплайсинга (см. рис. 148). Сближение экзонов создает условие для атаки З"-конца интрона адениловым нуклеотидом, расположенным вблизи З"-конца. В результате разрыва фосфодиэфирной связи между экзоном 1 и 5"-концом интрона последний взаимодействует с адениловым нуклеотидом и образованием в интроне петли типа «лассо» (см. рис. 148_Коничев). Вслед за этим освободившийся З"-ОН-конец экзона 1 разрезает З"-сайт сплайсинга, выщепляет интрон и, соединяясь с экзоном 2, образует в итоге зрелую (сплайсированную) молекулу мРНК]

Все стадии процессинга и-РНК происходят в РНП-частицах (рибонуклеопротеидных комплексах).

По мере синтеза про-и-РНК, она тут же образует комплексы с ядерными белками – информоферами . И в ядерные, и в цитоплазматические комплексы и-РНК с белками (информосомы ) входят s-РНК (малые РНК).

Таким образом, и-РНК не бывает свободной от белков, поэтому на всем пути следования до завершения трансляции и-РНК защищена от нуклеаз. Кроме того, белки придают ей необходимую конформацию.

Пока вновь синтезированная про-и-РНК (первичный транскрипт или гя-РНК – гетерогенная ядерная РНК) еще находится в ядре, она подвергается процессингу и превращается в зрелую и-РНК, прежде чем начать функционировать в цитоплазме. Гетерогенная ядерная РНК копирует всю нуклеотидную последовательность ДНК от промотора до терминатора, включая нетранслируемые области. После этого гя-РНК претерпевает преобразования, которые обеспечивают созревание функционирующей матрицы для синтеза полипептидной цепочки. Обычно гя-РНК в несколько раз (иногда в десятки раз) больше зрелой и-РНК. Если гя-РНК составляет примерно 10 % генома, то зрелая и-РНК – только 1-2 %.

В ходе ряда последовательных стадий процессинга из про-и-РНК (транскрипта) удаляются некоторые фрагменты, ненужные в последующих стадиях, и происходит редактирование нуклеотидных последовательностей.

При кэпировании происходит присоединение к 5"-концу транскрипта 7-метилгуанозина посредстом трифосфатного моста, соединяющего их в необычной позиции 5"-5", а также метилирование рибоз двух первых нуклеотидов. Процесс кэпирования начинается еще до окончания транскрипции молекулы про-и-РНК. По мере образования про-и-РНК (еще до 30-ого нуклеотида), к 5"-концу, несущему пуринтрифосфат, присоединяется гуанин, после чего происходит метилирование.

Функции кэп-группы:

ü регулирование экспорта и-РНК из ядра;

ü защита 5"-конца транскрипта от экзонуклеаз;

ü участие в инициации трансляции: узнавание молекулы и-РНК малыми субъединицами рибосомы и правильная установка и-РНК на рибосоме.

Полиаденилирование заключается в присоединении к 3"-концу транскрипта остатков адениловой кислоты, который осуществляет специальный фермент poly(A)-полимераза.

Когда синтез про-и-РНК завершен, то на расстоянии примерно 20 нуклеотидов в направлении к 3"-концу от последовательности 5"-AAУAA-3" происходит разрезание специфической эндонуклеазой и к новому 3"-концу присоединяется от 30 до 300 остатков АМФ (безматричный синтез).

Сплайсинг [англ. “splice” – соединять, сращивать]. После полиаденилирования про-и-РНК подвергается удалению интронов. Процесс катализируется сплайсосомами и называется сплайсингом. В 1978 г. Филипп Шарп (Массачусетский технологический институт) открыл явление сплайсинга РНК.

Сплайсинг показан для большинства и-РНК и некоторых т-РНК. У простейших найден автосплайсинг р-РНК. Сплайсинг показан даже для археобактерий.

Не существует единого механизма сплайсинга. Описано по крайней мере 5 разных механизмов: в ряде случаев сплайсинг осуществляют ферменты-матюразы, в некоторых случаях в процессе сплайсинга участвуют s-РНК. В случае автосплайсинга процесс происходит благодаря третичной структуре про-р-РНК.

Для и-РНК высших организмов существуют обязательные правила сплайсинга:

Правило 1 . 5" и 3" концы интрона очень консервативны: 5"(ГT-интрон-AГ)3" .

Правило 2 . При сшивании копий экзонов соблюдается порядок их расположения в гене, но некоторые из них могут быть выброшены.

Точность сплайсинга регулируют s-PНК: малые ядерные РНК (мя-РНК) , которые имеют участки, комплементарные концам интронов. мя-РНК комплементарна нуклеотидам на концах интронов – она временно соединяется с ними, стягивая интрон в петлю. Концы кодирующих фрагментов соединяются, после чего интрон благополучно удаляется из цепи.

③ ТРАНСЛЯЦИЯ [от лат. “translatio” – передача] заключается в синтезе полипептидной цепи в соответствии с информацией, закодированной в и-РНК. Молекула и-РНК (после процессинга у эукариот и без процессинга у прокариот) участвует в другом матричном процессе – трансляции (синтезе полипептида), который протекает на рибосомах (рис. 58).

Рибосомы – немембранные самые мелкие клеточные органоиды, при этом они едва ли не самые сложные. В клетке Е. coli присутствует около 10 3 – 5x10 3 рибосом. Линейные размеры прокариотической рибосомы 210 х 290Å. У эукариот – 220 х 320Å.

Выделяют четыре класса рибосом:

1. Прокариотические 70S.

2. Эукариотические 80S.

3. Рибосомы митохондрий (55S – у животных, 75S – у грибов).

4. Рибосомы хлоропластов (70S у высших растений).

S – коэффициент седиментации или константа Сведберга . Отражает скорость осаждения молекул или их компонентов при центрифугировании, зависящую от конформации и молекулярного веса.

Каждая рибосома состоит из 2-х субъединиц (большой и малой).

Сложность объясняется тем, что все элементы рибосом представлены в одном экземпляре, за исключением одного белка, присутствующего в 4 копиях в 50S субъединице, и не могут быть заменены.

р-РНК выполняют не только функцию каркасов субъединиц рибосом, но и принимают непосредственное участие в синтезе полипептидов.

23S р-РНК входит в каталитический пептидилтрансферазный центр, 16S р-РНК необходима для установки на 30S субъединице инициирующего кодона и-PHK, 5S р-РНК – для правильной ориентации аминоацил-тPHK на рибосоме.

Все р-РНК обладают развитой вторичной структурой: около 70% нуклеотидов собрано в шпильки.

р-РНК в значительной степени метилированы (СН 3 -группа во втором положении рибозы, а также в азотистых основаниях).

Порядок сборки субъединиц из р-РНК и белков строго определен. Субъединицы, не соединенные друг с другом, представляют собой диссоциированные рибосомы. Соединенные – ассоциированные рибосомы. Для ассоциации нужны не только конформационные изменения, но и ионы магния Mg 2+ (до 2x10 3 ионов на рибосому). Магний нужен для компенсации отрицательного заряда р-РНК. Все реакции матричного синтеза (репликация, транскрипция и трансляция) связаны с ионами магния Mg 2+ (в меньшей степени – марганца Мn 2+).

Молекулы т-РНК представляют собой относительно небольшие нуклеотидные последовательности (75-95 нуклеотидов), комплементарно соединённые в определённых участках. В результате формируется структура, напоминающая по форме лист клевера, в которой выделяют две наиболее важные зоны – акцепторная часть и антикодон.

Акцепторная часть т-РНК состоит из комплементарно соединённых 7 пар оснований и несколько более длинного одиночного участка, заканчивающегося 3′-концом, к которому присоединяется транспортируемая соответствующая аминокислота.

Другой важный участок т-РНК – антикодон , состоящий из трёх нуклеотидов. Этим антикодоном т-РНК по принципу комплементарности определяет себе место на и-РНК, определяя тем самым очерёдность присоединения транспортируемой им аминокислоты в полипептидную цепочку.

Наряду с функцией точного узнавания определённого кодона в и-РНК молекула т-РНК связывается и доставляет к месту синтеза белка определённую аминокислоту, присоединённую ферментом аминоацил-тРНК-синтетазы. Этот фермент обладает способностью к пространственному узнаванию, с одной стороны, антикодона т-РНК и, с другой, – соответствующей аминокислоты. Для транспортировки 20 типов аминокислот используются свои транспортные РНК.

Процесс взаимодействия и-РНК и т-РНК, обеспечивающий трансляцию информации с языка нуклеотидов на язык аминокислот, осуществляется на рибосомах.

Рибосомы представляют собой сложные комплексы рибосомной РНК (р-РНК) и разнообразных белков. Рибосомная РНК является не только структурным компонентом рибосом, но и обеспечивает связывание её с определённой нуклеотидной последовательностью и-РНК, устанавливая начало и рамку считывания при образовании пептидной цепи. Кроме того, они обеспечивают взаимодействие рибосомы с т-РНК.

В рибосомах имеются две зоны. Одна из них удерживает растущую полипептидную цепь, другая – и-РНК. Кроме того, в рибосомах выделяют два участка, связывающих т-РНК. В аминоацильном участке размещается аминоацил-т-РНК, несущая определённую аминокислоту. В пептидильном находится т-РНК, которая освобождается от своей аминокислоты и покидает рибосому при её перемещении на один кодон и-РНК.

В процессе трансляции выделяют следующие стадии :

1. Стадия активации аминокислот . Активация свободных аминокислот осуществляется при помощи особых ферментов (аминоацил-тРНК-синтетаз) в присутствии АТФ. Для каждой аминокислоты существует свой фермент и своя т-РНК.

Активированная аминокислота присоединяется к своей т-РНК с образованием комплекса аминоацил-т-РНК (аа-т-РНК). Только активированные аминокислоты способны образовывать пептидные связи и формировать полипептидные цепочки.

2. Инициация . Начинается с присоединения лидирующего 5"-конца и-РНК с малой субъединицей диссоциированной рибосомы. Соединение происходит так, что стартовый кодон (всегда АУГ) оказывается в «недостроенном» Р-участке. Комплекс аа-т-РНК с помощью антикодона т-РНК (УАЦ) присоединяется к стартовому кодону и-РНК. Имеются многочисленные (особенно у эукариот) белки – факторы инициации .

У прокариот стартовый кодон кодирует N-формилметионж, а у эукариот – N-метионин. В дальнейшем эти аминокислоты вырезаются ферментами и не входят в состав белка. После образования инициирующего комплекса происходит объединение субъединиц и «достраивание» Р- и А-участков (рис.60).

3. Элонгация . Начинается с присоединения в А-участок и-РНК второго комплекса аа-т-РНК с антикодоном, комплементарным следующему кодону и-РНК. В рибосоме оказываются две аминокислоты, между которыми возникает пептидная связь. Первая т-РНК освобождается от аминокислоты и покидает рибосому. Рибосома перемещается вдоль нити и-РНК на один триплет (в направлении 5"→3"). 2-я аа-т-РНК перемещается в Р-участок, освобождая А-участок, который занимает следующая 3-я аа-т-РНК. Таким же образом присоединяются 4-я, 5-я и т. д. аминокислоты, принесенные своими т-РНК.

4. Терминация . Завершение синтеза полипептидной цепочки. Наступает тогда, когда рибосома дойдет до одного из терминирующих кодонов. Имеются особые белки (факторы терминации ), которые узнают эти участки.

На одной молекуле и-РНК может располагаться несколько рибосом (такое образование называется полисома), что позволяет осуществлять синтез нескольких полипептидных цепей одновременно

Процесс биосинтеза белка проходит с участием большего количества специфических биохимических взаимодействий. Он представляет собой фундаментальный процесс природы. Несмотря на чрезвычайную сложность (особенно в клетках эукариот), синтез одной молекулы белка длится всего 3-4 секунды.

Аминокислотная последовательность выстраивается при помощи транспортных РНК (т-РНК), которые образуют с аминокислотами комплексы - аминоацил-тРНК. Каждой аминокислоте соответствует своя т-РНК, имеющая соответствующий антикодон, «подходящий» к кодону и-РНК. Во время трансляции рибосома движется вдоль и-РНК, по мере этого наращивается полипептидная цепь. Биосинтез белка обеспечивается за счет энергии АТФ.

Готовая белковая молекула затем отщепляется от рибосомы и транспортируется в нужное место клетки, но для достижения своего активного состояния белкам требуется дополнительная посттрансляционная модификация.

Биосинтез белка происходит в два этапа. В первый этап входит транскрипция и процессинг РНК, второй этап включаеттрансляцию. Во время транскрипции фермент РНК-полимераза синтезирует молекулу РНК, комплементарную последовательности соответствующего гена (участка ДНК). Терминатор в последовательности нуклеотидов ДНК определяет, в какой момент транскрипция прекратится. В ходе ряда последовательных стадий процессинга из мРНК удаляются некоторые фрагменты, и редко происходит редактирование нуклеотидных последовательностей. После синтеза РНК на матрице ДНК происходит транспортировка молекул РНК в цитоплазму. В процессе трансляции информация, записанная в последовательности нуклеотидов, переводится в последовательность остатков аминокислот.

19.ДНК. Строение, свойства, кодовая система.

Это совокупность процессов обеспечивающих превращение синтезированной РНК (РНК-транскрипта) в функционально активные РНК (зрелые РНК), которые могут быть использованы при синтезе белков. Сами РНК-транскрипты функционально не активные. Процесс характерен для эукариот.

В результате процессинга изменяется структура и химическая организация РНК. РНК-транскрипт до образования зрелой РНК носит название про-иРНК (или в зависимости от вида РНК – про-тРНК, про-рРНК), т.е. предшественница РНК. Практически все РНК-транскрипты эукариот и прокариот(за исключением иРНК прокариот) подвергаются процессингу. Превращение РНК-транскрипта в зрелую РНК начинается в ядре, когда синтез РНК ещё не закончен и она не отделилась от ДНК. В зависимости от механизмов различают несколько этапов созревания РНК.

Взаимодействие про-иРНК с белком.

Метилирование про-иРНК.

Кэпирование 5’-конца.

Полиаденилирование.

Сплайсинг.

Графическая последовательность этапов изображена на рисунке 58. Следует отметить, что в живых организмах все вышеперечисленные процессы идут параллельно друг другу.

а. Взаимодействие про-иРНК с белком.

У бактерий ещё до окончания транскрипции 5 ’ конец транскрипта сразу же соединяется с рибосомой и иРНК включается в трансляцию. Поэтому, для бактериальной иРНК практически никакая модификация не требуется. У эукариот, синтезированный транскрипт выходит из ядра, попадает в цитоплазму и там соединиться с рибосомой. На своём пути он должен быть ограждён от случайных встреч с сильными реагентами и, в тоже время быть, доступен ферментам процессинга. Поэтому РНК-транскрипт сразу же по мере удлинения взаимодействует с белком. Здесь уместна аналогия – РНК-транскрипт располагается на белке как на операционном столе, он фиксируется химическими связями, одновременно в нём становятся доступными места модификации. РНК, связанная с белком, носит название рибонуклеопротеид (информосома). В такой форме транскрипт находится в ядре. При выходе из ядра одни РНК продолжают оставаться в соединении с белком, другие выходят из комплекса и принимают участие в трансляции.

б. Метилирование про-иРНК.

Чаще всего происходит у бактерий, у которых имеется специальный аппарат защиты от чужеродной

ДНК (вирусной, фаговой). Этот аппарат состоит из целого ряда ферментов разрезающих чужеродную ДНК или РНК в определённых сайтах в которой находится специфическая последовательность нуклеотидов. Ферменты носят название – рестриктазы . Понятно, что собственный, только что синтезированный РНК-транскрипт, также может быть подвергнут атаке рестриктаз. Чтобы это не случилось специальные ферменты, называемые метилазы, метилируют собственный РНК-транскрипт в тех сайтах, которые могут быть разрезаны собственными ферментами. У эукариот РНК-транскрипт метилируется в меньшей степени.

Промотор Терминатор

Транскрипция

Про-иРНК фикси- Белок

рванная на белке

Метилирование про-иРНК

Кэпирование про-иРНК

Рис. 58. Схема основных моментов процессинга.

в. Кэпирование 5’конца.

Заключается в химическом и конформационном изменении

5’конца синтезированной РНК. Кэпирование происходит в момент синтеза РНК, ещё до её отделения. Процесс заключается в присоединении к свободному концу про-РНК специальных химических веществ, которые изменяют конформацию концевого участка. Кэпирование необходимо для инициации процесса трансляции.

Специальные ферменты присоединяют к 5’концу про-иРНК ГДФ (гуанозиндифосфат), а затем метилируют его.

5’ про-иРНК

СН 3

КЭП = ГДФ + СН 3

Рис.59. Структура КЭПа на 5’конце пре-иРНК эукариот.

Функции КЭПа.

Инициирует синтез белка.

Предохраняет про-иРНК от распада.

Участвует в удалении интронов.

г. Полиаденилирование.

Это процесс присоединения к 3’ концу про-иРНК 100 – 200 остатков адениловой кислоты. Эти остатки носят название поли-А последовательности (поли-А хвосты). Полиаденилированию подвергаются не все про-иРНК. Например, молекулы всех типов гистонов не содержат поли-А последовательности. Полиаденилирование предохраняет иРНК от разрушения.

На растущей цепи и-РНК имеется специальная последовательность нуклеотидов (ААУААА). Особый фермент (полиА-полимераза) находит это сочетание нуклеотидов, разрезает про-иРНК в этом месте и формирует полиадениловый хвостик.

Значение поли –А последовательностей:

Облегчают выход иРНК из ядра в цитоплазму.

Предохраняют иРНК от разрушения.

Недавно было выявлено ещё одно интересное свойство поли-А последовательностей – они участвуют в терминации синтеза про-иРНК. РНК-полимераза, формируя последовательность ААУААА в про-иРНК, получает сигнал о завершении синтеза РНК-транскрипта. Но синтез сразу не прекращается. Полная остановка его наступает после того, как РНК-полимераза встречает на матричной нити ДНК специфическую последовательность нуклеотидов (у разных генов она разная), которая и даёт окончательный сигнал о прекращении синтеза РНК.

ГТФ ПолиА - последовательность

рАрАрАрАрАрАрАрА-ОН

СН 3

КЭП = ГТФ + СН 3

Рис. 60. Структура КЭПа на 5’конце про-иРНК эукариот и полиадениловая последовательность на 3’конце про -иРНК.

д. Сплайсинг.

В РНК-транскрипте содержится определённое количество нуклеотидных последовательностей, которые были необходимы для успешного завершения трансляции и последующей модификации транскрипта (кэпирования, полиаденилирования и т.д.). Для выполнения основной роли РНК в цитоплазме – трансляции, эти последовательности не только не будут иметь функционального значения, но могут помешать нормальному течению синтеза белка. Поэтому в клетке предусмотрен механизм освобождения первичного транскрипта от целого ряда последовательностей, не имеющих решающего значения в трансляции.

К таким последовательностям прежде всего относят интроны.

Ген, с которого транскрибировалась про-иРНК содержит кодирующие и некодирующие последовательности. Кодирующие последовательности гена определяют аминокислоту и их последовательность в белке. Не кодирующие последовательности таким свойством не обладают. Кодирующие и некодирующие последовательности в гене чередуются, и их количество зависит от индивидуальных генов. В первичном транскрипте также содержатся кодирующие и некодирующие последовательности. Такая организация генов и про-РНК характерна для эукариот. Некодирующие последовательности про-иРНК носят название интроны , а кодирующие –экзоны. Длина интронов может быть от 50 до 12000 нуклеотидов. Ген начинается и

кончается экзоном. Прерывистое строение гена характерно для большинства эукариот. Интроны могут содержать все виды РНК – иРНК, тРНК, рРНК.

Вся совокупность экзонов (кодирующих белки) в геноме человека занимают всего 1,1 – 1,4 %. Средний ген человека содержит 9 интронов. По мере упрощения

организации организмов совокупная величина их экзонов возрастает (например у бактерий она равна 86%).

В вырезании интронов из РНК-транскрипта и сшивании оставшихся экзонов, принимает участие многокомпонентный комплекс. Основными его составляющими являются малые ядерные РНК (мяРНК) и белки-ферменты.

В целом комплекс носит название малые ядерные рибонуклеопротеиды, мяРНП или сплайосома . Сам процесс достаточно сложен и состоит из нескольких этапов (см. рис. 58).

1. Формирование сплайосомы . К началу и концу интрона прикрепляются фрагменты белка и мяРНК (рис. 56, Д) формируя сплайосому. (рис. 56, Д) Прикрепление комплекса мяРНП (рис. 56, Е).

Экзон 1 Интрон Экзон 2

Петля

интрона вырезана

Рис. 61. Схема сплайсинга (объяснение в тексте).

Сближение соседних экзонов, за счёт образования петли интрона. Разрезание на границе экзон-интрон и соединение соседних (первого и второго) экзонов(рис. 56, В).

Удаление и разрушение петли и сплайосоме (рис. 56, Г, Ж).

Необходимо отметить, что при повреждении (мутации) интрона сплайсинг может быть не закончен, интрон не вырезан и конченый продукт – иРНК будет нести несвойственные ей последовательности нуклеотидов. Понятно, что это может привести к нарушению трансляции и выключению из метаболизма определённого белка

е. Альтернативный сплайсинг.

Такой тип сплайсинга происходит при экспрессии одного и того же гена в разных тканях.

Сущность его в том, что один и тот же участок гена в разных тканях может выступать в качестве интрона и экзона. Это приводит к образованию разных иРНК, которые кодируют белки с различной ферментативной активностью.

Так в клетках щитовидной железы синтезируется гормон кальцитонин. Он тормозит высвобождение кальция из костей. Ген, контролирующий синтез каль-

Ген, контролирующий кальцитонин

э и э и э и э и э и э

1 2 3 4 5 6

э и э и э и э и э и э

про-иРНК

1 2 3 4 5 6

В щитовидной железе В клетках головного мозга

иРНК

1 2 3 4 1 2 3 5 6

Кальцитонин Кальцитонинподобный белок

Рис.62. Альтернативный сплайсинг кальцитонина и кальцитонин-подобного белка.

цитонина, состоит из 6 экзонов, первичный транскрипт этого гена (про-иРНК) также состоит из 6 экзонов (рис. 62). Из первичного транскрипта формируется зрелая иРНК содержащая 4 экзона – 1,2,3,4. Экзоны № 5 и 6 были прочитаны как интроны и вырезаны. На основе такой и РНК синтезируется кальцитонин. В клетках головного мозга из первичного транскрипта, содержащего 6 экзонов, формируется зрелая иРНК, состоящая из 5 экзонов – 1,2,3,5,6. Четвёртый экзон был вырезан как интрон. Такая иРНК контролирует синтез кальцитонинподобного белка, отвечающего за вкусовое восприятие.

Другой ген Icarus (в названного в честь легендарного Икара) способен обеспечить за счёт альтернативного сплайсинга синтез 6 различных полипептидов. Кроме этого полипептиды образуют между собой в клетке около 20 различные ансамбли из одних и тех же полипептидов или различных.

Нарушение механизма сплайсинга может привести к патологическим состояниям, которые носят общее название талассемии . К ним относят заболевания связанные с частичным или полным подавление синтеза одной из цепей гемоглобин (α- или β-цепей). Например, болезни, связанные с недостатком синтеза β -цепи гемоглобина, могут возникнуть в результате мутаций в двух участка гена, кодирующего β-цепь – в сайте ответственном за полиаденилирование и в одном из интронов. В первом случае нарушается процесс формирования полиаденилового хвостика и формируется неполноценная β-цепь гемоглобина. Во втором случае сплайосома не способна вырезать повреждённый интрон и зрелая иРНК β-цепи гемоглобина не образуется. В любом случае нормальная функция эритроцитов будет существенно нарушена.

МЗ. Процессинг (или созревание РНК) это процесс превращения только что синтезированной, не активной РНК (про-иРНК) в функционально активную РНК. Процесс связан со структурными и химическими модификациями про-иРНК. Происходит в ядре до момента выхода РНК в цитоплазму. Состоит из нескольких этапов: присоединение про-иРНК к белку, метилирование некоторых оснований, маркировка одного из концов, полиаденилирование другого (противоположного) конца, вырезания интронов и сшивание экзонов. Последние два процесса носят название сплайсинг.

Вопросы к экзаменам.

1. Каким образом ферменты определяют большинство мест, где имеется повреждение молекулы ДНК?

ОТВЕТ. В месте повреждения молекулы ДНК в большинстве случаев наступает локальная денатурация. Её и определяют ферменты.

2. Что происходит в месте повреждения молекулы ДНК?

ОТВЕТ. В месте повреждения наступает локальная денатурация.

3. На основании чего ферменты репарации восстанавливают необходимую последовательность нуклеотидов в месте повреждения одной нити ДНК?

ОТВЕТ. На основании принципа комплементарности к нуклеотидам оппозитного участка нити ДНК.

4. На основании чего ДНК-полимераза правильно застраивает нуклеотидами бреши в повреждённой нити ДНК?

ОТВЕТ. На основании принципа комплементарности нуклеотидов застраиваемой цепи к нуклеотидам оппозитной нити.

5. Какой тип репарации осуществляется ферментом, который активируется фотоном?

ОТВЕТ. Фотореактивация.

6. Какой фермент осуществляет репарацию используя энергию солнца?

ОТВЕТ. Фотолиаза.

Какой фермент принимает непосредственное участие в синтезе молекуле РНК?

ОТВЕТ. ДНК-зависимая РНК-полимераза или РНК-полимераза.

Перечислите периоды транскрипции.

ОТВЕТ. Инициация, элонгация, терминация.

Из каких компонентов состоит инициаторный комплекс в процессе транскрипции?

ОТВЕТ. Из специального белка осевшего на промотор, РНК-полимеразы и транскрипционных факторов.

9. Как называется участок ДНК, где формируется инициаторный комплекс в процессе транскрипции?

ОТВЕТ. На промоторе.

10. Как называется последовательность нуклеотидов у прокариот, которую определяет специальный белок осаждающий на промоторе в период инициации транскрипции?

ОТВЕТ. Блок Прибнова.

11. Как называется последовательность нуклеотидов у эукариот, которую определяет специальный белок осаждающий на промоторе в период инициации транскрипции?

ОТВЕТ. ТАТА-бокс.

12. Где в молекуле ДНК располагается блок Прибнова у прокариот?

ОТВЕТ. На промоторе.

13. Где в молекуле ДНК располагается ТАТА-бокс у эукариот?

ОТВЕТ. На промоторе.

14. Как называется ферментативный комплекс, который формирует транскрипционный глазок?

ОТВЕТ. Инициаторный комплекс.

15. Как называется участок молекулы ДНК с которого начинается синтез РНК?

ОТВЕТ. Стартовой точкой, сайт начала транскрипции.

16. Назовите нуклеотиды, которые находятся в терминаторе и возможно участвуют в прекращении транскрипции.

ОТВЕТ. Г,Ц.

17. Назовите вторичную структуру в терминаторе, которая возможно участвует в прекращении транскрипции,

ОТВЕТ. Шпилька.

18. Как называются кодоны находящиеся в терминаторе и возможно участвующие в прекращении транскрипции.

ОТВЕТ. Бессмысленные (нонсенс) кодоны.

Это процесс превращения транскрипта (пре-иРНК, полученной при транскрипции) в зрелую иРНК, пригодную для трансляции. Стадии процессинга:

1) Кэпирование
К 5"-концу транскрипта присоединяется кэп («шапочка», англ.), состоящая из модифицированного гуанина.

2) Полиаденирование
К 3"-концу транскрипта присоединяется от 100 до 200 адениновых нуклеотидов.

3) Сплайсинг
Это процесс вырезания из транскрипта нужных участков и склеивания их между собой. У эукариот из транскрипта выбрасывается в среднем 5/6 длины.

Зрелая иРНК состоит из 5 участков:

1) Кэп необходим для

• экспорта иРНК из ядра;
• предотвращения разрушения 5"-конца иРНК в результате действия экзонуклеаз;
• инициации трансляции.

2) 5"-НТО (нетранслируемая область) кодирует частоту трансляции. К 5"-НТО могут присоединяться репрессоры или активаторы, изменяющие способность данной иРНК соединяться с рибосомой.

3) Кодирующая область - с неё производится трансляция. Она начинается со старт-кодона АУГ и заканчивается одним из трех стоп-кодонов.

4) 3"-НТО кодирует скорость разрушения данной иРНК нуклеазами. К 3"-НТО могут присоединяться репрессоры или активаторы, изменяющие скорость разрушения.

5) Поли-А тоже отвечает за срок жизни иРНК в цитоплазме.